RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuove frontiere nella stratificazione delle leucemie acute linfoidi (LAL): integrazione tra citogenetica non-convenzionale, genomica e post-genomica

Università di riferimento

Università degli Studi di PERUGIA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Cristina Mecucci

Descrizione

Obiettivi:
Questa Unità si prefigge lo scopo di effettuare un’analisi completa del genoma per identificare gli eventi molecolari che concorrono, in ogni singolo caso, a determinare il fenotipo leucemico.
1. Creazione di “FISH multiplex” per l’analisi simultanea di un panel di 30 sonde.
2. Utilizzo della DHPLC per l’analisi mutazionale di geni noti ed eventuale analisi di nuovi geni candidati che emergeranno dal progetto.
3. Identificazione di sbilanciamenti genomici criptici (usando micro-array CGH e SNPs) e loro associazione con gli altri eventi molecolari (punto 1 e 2).
4. Elaborazione di algoritmi diagnostici che integrino le diverse tecnologie e dedicati alla diagnosi di sottogruppi molecolari di LAL-T e LAL-B.
5. Correlazioni clinico-prognostiche dei sottogruppi genomici di LAL.


Fattibilità
Tutte le tecnologie che verranno utilizzate nel progetto sono in uso e validate nell’Unità scrivente. La tecnologia degli SNPs è in sviluppo in collaborazione con l’Unità del Coordinatore del progetto che ha in dotazione un Sistema Affymetrix.


Materiali e Metodi

Cariotipizzazione
Il cariotipo delle piastre metafisiche sarà eseguito dopo bandeggio G (con colorante di Wright) o R (con arancio di acridina) dei cromosomi. L’analisi sarà effettuata su almeno 30 metafasi in modo da poter rilevare anche piccoli cloni cellulari anormali. Per la cariotipizzazione saranno utilizzati sistemi semiautomatici (Applied Imaging e Metasystem).

Sonde per una FISH multiplex
In aggiunta alle sonde commerciali per le traslocazioni note, l’Unità scrivente ha selezionato, marcato e validato su campioni normali 30 sonde di DNA che consentono di studiare punti di rottura/loci genici/geni noti per il loro coinvolgimento nelle LAL (vedi lista nella tabella 4). Ulteriori integrazioni del pannello sono previste in relazione alla identificazione di nuove anomalie specifiche e ricorrenti nel corso dello sviluppo del progetto. Tali sonde costituiscono gli strumenti di screening attraverso la FISH multiplex.


Crescita di vettori e purificazione di sonde di DNA per la FISH
I vettori (plasmidi, cosmidi, PAC, e BAC) vengono prima cresciuti in terreni solidi (in piastre) a partire da stabs in glicerolo o in agar e, successivamente, singole colonie prelevate dalle piastre di coltura vengono fatte espandere in terreni liquidi arricchiti con fattori di crescita. Le cellule con l’inserto di DNA possono essere selezionate grazie all’aggiunta di appropriate sostanze, a tutti gli stadi di crescita, sfruttando la presenza di loci che conferiscono alla cellula una specifica antibiotico-resistenza o altre proprietà metaboliche. La purificazione del DNA dei cosmidi, PAC e BAC dall’RNA, dalle proteine e da altri contaminanti cellulari si ottiene attraverso la lisi del batterio in presenza di RNAsi e in condizioni di alcalinità. Una ulteriore purificazione sarà effettuata utilizzando colonne di resina a scambio anionico che trattengono solo il DNA plasmidico. Quest’ultimo sarà successivamente eluito dalle colonne con una serie di lavaggi, purificato dai sali e concentrato tramite precipitazione con isopropanolo. Il DNA verrà infine lavato in etanolo, risospeso in buffer TE (tris EDTA) e marcato al fine di ottenere le sonde utilizzabili negli esperimenti di FISH.

Ibridazione in situ in fluorescenza (FISH)
Nel presente progetto la FISH sarà applicata per l’identificazione dell’evento(i) molecolare che sottende i diversi tipi di riarrangiamento cromosomico, per la rilevazione di eventi criptici alla citogenetica convenzionale e per indirizzare il clonaggio di nuovi geni coinvolti nella patogenesi delle leucemie.
I vetrini, dove è stato allestito il campione che si vuole studiare, vengono pretrattati con RNAsi e pepsina o con proteinasi K; il DNA target e la(e) sonda(e) selezionata(e) vengono denaturate, ad alta temperatura, in una soluzione di formamide. Segue l'ibridazione che si effettua con un'incubazione a 37°C per 15-17 ore. I lavaggi post-ibridazione vengono effettuati in condizioni di stringenza variabile e adattata al tipo di sonda(e) utilizzata(e). Dopo l'ibridazione le sonde, legate ad apteni, vengono rivelate attraverso l'utilizzo di molecole coniugate a fluorocromi. Per l'ibridazione di sequenze molto piccole viene praticato una seconda incubazione con anticorpi fluorescenti al fine di amplificare l'intensità del segnale.
La FISH Multiplex, messa a punto per un rapido screening diagnostico delle LAL, è eseguita con piccole modificazioni rispetto al protocollo standard: 1) il trattamento proteolitico dei vetrini è più prolungato e fatto con concentrazioni maggiori di pepsina e 2) il DNA target e le sonde vengono denaturate simultaneamente su piastra ad alta temperatura.
La FISH può essere applicata su preparati di citogenetica (metafasi e nuclei in interfase), su preparati citologici e su sezioni di tessuto al criostato o inclusi in paraffina. Le sonde FISH distribuite in commercio e utilizzate in casi selezionati sono: sonde per le sequenze alfa satellitari delle regioni centromeriche, sonde per le regioni telomeriche e subtelomeriche, sonde per interi cromosomi (WCP) o specifiche per un braccio (lungo o corto) cromosomico, sonde per riarrangiamenti cromosomici e/o geni tipicamente coinvolti in onco-ematologia.

Multicolor-FISH
La multicolor-FISH è un approccio di citogenetica molecolare basata sull’uso simultaneo di 24 sonde painting specifiche per ogni coppia di cromosomi omologhi (dal cromosoma 1 al 22) e per i cromosomi sessuali (X e Y). Questo approccio di FISH è particolarmente utile per capire la natura di marcatori cromosomici, rilevare traslocazioni non evidenti alla citogenetica convenzionale, e identificare riarrangiamenti cromosomici complessi. Per la multicolor-FISH, la nostra Unità utilizza i kit SpectraVision (Vysis, Abbott) e Metasystem, costituiti da una miscela di sonde painting marcate con diverse combinazioni di 5 fluorocromi. Le sonde multiple presenti nel kit vengono applicate sugli stessi preparati cromosomici utilizzati per la citogenetica convenzionale. I vetrini vengono pretrattati con RNAsi e pepsina e denaturati in una soluzione di formamide a 73°C per 5 minuti. Le sonde, dopo denaturazione ad alta temperatura, vengono distribuite sui vetrini e incubate a 37°C per 24-48 ore per l’ibridazione. I lavaggi post- ibridazione vengono eseguiti come da protocollo suggerito dalla ditta produttrice. L'analisi viene eseguita con l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza (Olympus o Zeiss) corredado di una CCD, di un software di analisi di immagine specifico, e di un set di 5 filtri specifici per i diversi fluorocromi, più un filtro dapi (4,6-diamino-2-phenylindole, dihydrochloride) che ha la funzione di controcolorare i cromosomi.

Ibridazione Genomica Comparativa (CGH)
La CGH in metafase evidenzia la presenza di eventuali sbilanciamenti genomici in ogni singola regione cromosomica. L’applicazione di queste metodiche ci ha consentito di fornire una diagnosi genetica recuperando importanti informazioni biologiche in oltre il 60% dei pazienti con LAL-B e LAL-T a cariotipo normale o fallito per assenza di mitosi, arruolati nel protocollo GIMEMA per lo studio e il trattamento delle LAL dell’adulto (Mecucci C et al. Lavoro in approvazione). Questo tipo di approccio è anche di fondamentale importanza per la diagnosi di amplificazioni di singoli oncogeni come MLL/11q23, AML1/21q22, C-MYC/8q24 e ABL1/9q34, che rappresentano eventi molecolari ricorrenti in specifici sottogruppi di neoplasie ematologiche. Le amplificazioni di MLL sono tipiche di LAM e prognosi sfavorevole. Le amplificazioni del gene AML1/21q22, seppur rare, sono tipicamente associate ad un sottogruppo di LAL a cellule B. L’amplificazione del gene ABL1/9q34, la tirosin-chinasi tipicamente alterata nella leucemia mieloide cronica Filadelfia-positiva, è stata recentemente identificata in un sottogruppo di LAL a cellule T. Sarà nostro intento ricercare sbilanciamenti criptici nei pazienti affetti da LAL. In particolare questo tipo di approccio ci consentirà di identificare nuove entità clinico-genetiche nei pazienti con cariotipo normale, e di delucidare il significato molecolare delle diverse anomalie nei pazienti con cariotipo anormale.
La CGH viene eseguita in accordo con il protocollo descritto da Kallioniemi A et al. (1992) con piccoli adattamenti. Il DNA test può essere estratto da vari tessuti (midollo emopoietico, sangue periferico o tessuti neoplastici inclusi in paraffina) mentre il DNA di riferimento (normale) viene estratto dal sangue periferico di donatori sani. Dopo l’estrazione i DNA vengono marcati con una miscela di nucleotidi dCTP e dUTP legati a fluorocromi diversi (texas red per il DNA normale e la FITC per il DNA test) come descritto da El-Rifai W et al. (1997), in modo da ottenere frammenti di DNA di 600-2000 paia di basi.
Durante l’ibridazione i due DNA competeranno per il legame agli stessi siti target sui cromosomi metafasici. I lavaggi post-ibridazione prevedono tre passaggi in formamide al 50%/2XSSC, due in 2XSSC e 1 in 0,1XSSC a 45°C, seguiti da 1 lavaggio in 2XSSC, buffer PN (0,1M NaH2PO4/0,1M Na2HPO4/0,1% NP40, pH 8,0) e acqua distillata (10 minuti ciascuno). Dopo deidratazione in etanoli a concentrazioni scalari, i cromosomi sono controcolorati con DAPI dissolto in una soluzione di "antifade" (Vectashield, Vector). L’analisi delle metafasi viene eseguita utilizzando un software di analisi di immagine (Applied Imaging) tramite un microscopio a fluorescenza Olympus utilizzando filtri corrispondenti a tre diverse frequenze di eccitazione corrispondenti al DAPI, alla FITC e al Texas Red. Un software dedicato calcolerà, su ogni sito di legame, il rapporto della fluorescenza emessa dai due fluorocromi (verde/rosso) che dovrà essere uguale a 1 se i due DNA saranno egualmente rappresentati; >1 se il DNA test è sopra-rappresentato (trisomie, duplicazioni, ampplificazioni); <1 se il DNA test sarà sotto-rappresentato (monosomie, delezioni).
I valori soglia (1,18 per le acquisizioni e 0,83 per le perdite) sono stati definiti sulla base di profili ottenuti da controlli normali. Le regioni centromeriche, le regioni eterocromatiche dei cromosomi 1,9, 16 e Y, e le regioni telomeriche sono escluse dall'analisi per la possibilità di falsi positivi.

Array CGH e SNPs
La array-CGH consente di avere una visione d’insieme, di tipo genomico, utilizzando cloni di DNA per specifici geni/loci di interesse. In un singolo esperimento è possibile valutare le perdite e le acquisizioni genomiche di tutto il pannello di cloni testati nell’esperimento. Per la array-CGH si applicano gli stessi principi della CGH convenzionale, ma i due DNA vengono ibridati su arrays in cui sono stati “spottati” i cloni di DNA (cDNA, BAC, PAC, o oligonucleotidi sintetici). Nella nostra Unità utilizziamo il sistema di array Spectral Chip Human BAC array Kit (Spectralgenomics, TX, USA) che è costituito di 3000 cloni BAC specifici per regioni genomiche poste ad una distanza di circa 1 Mb l’una dall’altra. L’analisi di acquisizioni e/o perdite di ciascun clone viene eseguita mediante uno scanner (GenePix Pro 6.0, Axon Instruments Inc, CA, USA) corredato da un software di cattura (GenePix Pro 6.0, Axon Instruments Inc, CA, USA) e uno di analisi (Spectralware, Spectralgenomics, TX, USA).
Un ulteriore sviluppo nell’analisi degli sbilanciamenti genomici è rappresentato dallo studio degli “SNP” o polimorfismi a carico di singoli nucleotidi. La metodologia più affermata è quella che usa il sistema Affymetrix in dotazione presso l’Ematologia dell’Università La Sapienza. La tecnologia si basa sulla amplificazione di DNA genomico frammentato e la successiva ibridazione su array contenenti sonde oligonucleotidiche. Il valore aggiunto determinante degli SNPs rispetto alla array-CGH è la possibilità di individuare una disomia uniparentale. L’unità scrivente sta sviluppando il protocollo di ibridazione secondo le istruzioni Affymetrix per la lettura dei preparati presso l’unità del Coordinatore del presente progetto.

Studi molecolari
L’RNA viene estratto mediante Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA) e purificato su colonna (RNeasy columns, Qiagen, Hilden, Germany). Successivamente tutto l’RNA viene retrotrascritto in cDNA utilizzando il Superscript II or il Thermoscript (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Saranno messe a punto RT-PCR specifiche al fine di identificare i prodotti di geni di fusione risultanti da anomalie cromosomiche, disegnando primers specifici e utilizzando DNA polimerasi con diversa termostabilità. La 3’/5’ RACE-PCR (3’ o il 5’ System Kit, Invitrogen) sarà invece applicata nei casi in cui si voglia identificare il gene partner di un riarrangiamento cromosomico in cui l’altro gene coinvolto è noto. I prodotti di PCR utilizzati per il clonaggio, saranno fatti correre su gel di elettroforesi, purificati con il kit QiaexII (Qiagen), ligati in pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) e successivamente utilizzati per trasformare E. coli con metodo chimico. Primers specifici saranno disegnati per geni di interesse selezionati al fine di studiare mutazioni somatiche attraverso il sistema del sequenziamento diretto. I geni verranno amplificati utilizzando termociclatori GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer) e Mastercycler ep Gradient (Eppendorf).

Analisi Mutazionale di geni candidati
L’unità scrivente ha recentemente scoperto e caratterizzato, per la prima volta al mondo, le mutazioni coinvolgenti il gene NPM1 in circa il 60% delle LAM dell’adulto con cariotipo normale. L’analisi mutazionale è stata estesa alle leucemie acute linfoblastiche mediante l’uso della dHPLC.
La DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) è una metodica estremamente efficiente per l’identificazione di mutazioni come sostituzioni di singole basi nucleotidiche, piccole inserzioni o delezioni, con una sensibilità e specificità superiore al 97%. In breve, in condizioni di parziale denaturazione, gli eteroduplici (allele normale-allele mutato) sono trattenuti meno rispetto ai corrispettivi omoduplici (allele normale-allele normale) nella stessa colonna cromatografica per la separazione del DNA (ion-pairing reversed phase liquid chromatography). La nostra Unità utilizza già da alcuni anni la procedura di DHPLC per l’analisi mutazionale di geni coinvolti in malattie onco-ematologiche. Il nostro sistema di analisi è il Wavemaker™ software (Wave™ System, MD Transgenomic Inc., Omaha, Nebraska, USA) e uno specifico programma di melting per DHPLC Melt Program (http://insertion.stanford.edu/melt.html). Le condizioni sperimentali sono ottimizzate studiando le alterazioni dei profili di eluizione dei campioni (“temperature mapping”). Per il sequenziamento si utilizza l’apparecchio 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Al momento abbiamo messo a punto metodiche di DHPLC per lo studio di eventi mutazionali a carico dei seguenti geni di interesse per il progetto: PTPN11, RAS, NOTCH1, and FBW7.