RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Nuove frontiere nella stratificazione delle leucemie acute linfoidi (LAL): integrazione tra citogenetica non-convenzionale, genomica e post-genomica

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO-BICOCCA - MEDICINA CLINICA E PREVENZIONE- DEPARTMENT OF CLINICAL AND PREVENTIVE MEDICINE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Andrea Biondi

Descrizione

Scopi
Il progetto si focalizzerà sulla caratterizzazione genomica dell’eterogeneità di sottogruppi di LAL di cui le risorse oggi disponibili non permettono una predizione accurata del decorso clinico. In modo specifico, sarà perseguita l’integrazione del profilo di genotipo, espressione genica, microRNA e fosfoproteomica di sottogruppi di LAL pediatrica classificati sulla base della MRM.
Questo sforzo ha lo scopo di identificare nuovi fattori di rischio per la classificazione e la stratificazione terapeutica, e di identificare nuove lesioni associate a vie alterate di risposta/resistenza a farmaci e geni bersaglio candidati nelle terapie delle LAL pediatriche.
Più in dettaglio, il WP1 userà lo stesso approccio di integrazione di tutti i dati genomici e proteomici disponibili nelle due principali aree, che si differenziano in base ai diversi sottogruppi di pazienti analizzati:

Task 1: Caratterizzazione genomica di sottogruppi di LAL pediatrica a cellule B e T, classificati sulla base di MRD.
Lo studio AIEOP-BFM LAL 2000 è stato il primo esempio di stratificazione di pazienti basato quasi interamente sulla valutazione quantitativa precoce della MRM, valutata alla fine della Induzione e prima del Mantenimento (t1, giorno 33; t2 , giorno 78). Il ramo ad Alto Rischio (HR) comprendeva alternativamente: i) pazienti con ?1000 blasti/µl sangue al giorno 8 dopo una fase preliminare di prednisone per 7 giorni e una dose di MTX IT; ii) pazienti con ?5% blasti al giorno 33; iii) pazienti con MRM ? 10-3 nel midollo prima del protocollo M; iv) presenza di t(9;22) (BCR/ABL) o t(4;11)(q11;q23) (MLL/AF4). I pazienti sono a Rischio Standard (SR) se MRD negativi t1 e t2, con almeno 2 marcatori con una sensibilità di 10-4, e senza caratteristiche cliniche di Alto Rischio. I pazienti con un intermedio livello di MRD sono stati stratificati nel gruppo di Rischio Medio (MR).
Questo studio, concluso in Luglio 2006, ha arruolato circa 5000 pazienti , di cui 42% italiani (all’anno in Italia: circa 350 pazienti).
La principale conclusione preliminare dello studio AIEOP-BFM LAL 2000, è che la valutazione della MRM è il fattore prognostico indipendente più rilevante nella LAL pediatrica.
Tuttavia, in ogni gruppo esiste ancora una eterogeneità clinica e una frazione variabile di pazienti ricade. Sebbene la stratificazione dei pazienti basata sulla MRM sia in grado di raffinare la presenza di sottogruppi di LAL relativamente omogenei, l’identificazione di questi pazienti che inaspettatamente ricadono all’interno dello stesso sottogruppo definito dall’MRM rimane ancora evasivo.
L’identificazione precoce di pazienti con tendenza alla ricaduta in ognuno di questi sottogruppi, così come lo studio della natura genetica e biologica della farmacoresistenza in questi pazienti, rappresenta il principale argomento di indagine.
Selezione dei Pazienti
Questa parte del progetto ha lo scopo di identificare aberrazioni genomiche criptiche all’interno di particolari sottogruppi di pazienti LAL pediatrici definiti sulla base dellaMRM come miglior surrogato per la risposta precoce al trattamento:
a) Pazienti rischio standard secondo MRM. Il gruppo a rischio standard include pazienti che ci sia spetta abbiamo un decorso eccellente, ma approssimativamente il 5-10% di questi ricadono (Ricaduto-SR). Nessuna anomalia genetica caratterizza questi pazienti.
b) Pazienti ad alto Rischio classificati esclusivamente sulla base della MRM al giorno 78 (“HR-MRD only”). Questi mostrano un decorso clinico peggiore rispetto agli altri pazienti ad alto rischio classificati sulla base di parametri clinici, come la scarsa risposta al prednisone (PPR) e la positività a t(4;11) e t(9;22) in citogenetica (Cytog.HR). I pazienti dopo 5 anni presentano una EFS approssimativamente del 35% contro i pazienti RES Ia (44%), Cytog.HR (51%), and PPR (82%) rispettivamente. Questi pazienti sfuggono ai fattori prognostici convenzionali e non potrebbero essere identificati senza monitoraggio della MRM.
Lo studio caso-controllo includerà quattro sottogruppi (per un totale di 100 pazienti): MRD-SR , MRD-SR ricaduti, HR-MRD only; HR-MRD only - ricaduti. Sia i campioni della diagnosi che della ricaduta verranno analizzati allo scopo di identificare: i) differenze gnomiche tra SR a HR alla diagnosi; ii) gli eventi genetici responsabili della causa e della progressione della malattia, in ogni sottogruppo. L’analisi tramite tecnica SNPs verrà eseguita sui campioni tumorali e i corrispondenti campioni della remissione, col duplice fine di identificare l’eventuale presenza di potenziali eventi predisponenti e di confermare che le anormalità identificate siano correlate alla patologia tumorale.
Ottenibile in 3 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 0 a 3 del progetto.

Task 2: LAL pediatriche con trascritto di fusione BCR/ABL arruolati al protocollo EsPhALL e precedenti.
La presenza del cromosoma Philadelphia è sempre stata associata a prognosi sfavorevole in diversi protocolli di trattamento. Una diversa cinetica di riduzione del numero di cellule leucemiche valutata con tecniche di PCR riflette una diversa propensione alla remissione completa. In uno studio prospettico su 27 pazienti con il trascritto BCR/ABL abbiamo in precedenza dimostrato l’eterogeneità anche nella risposta molecolare, discriminando già nelle fasi precoci pazienti con diverso rischio di ricaduta se trattati con una stessa terapia aggressiva. L’eterogeneità clinica è stata poi confermata nei protocolli successivi (LAL2000), in cui la MRM identifica circa il 15% di pazienti con risposta precoce alla terapia di alte dosi e buona sopravvivenza.
EsPhALL è un protocollo clinico internazionale di fase II/III, tra i principali gruppi cooperativi multicentrici, coordinato dal Prof. A.Biondi (PI di questa proposta). Si propone per la prima volta in modo controllato, nel contesto pediatrico della LAL, di valutare l’efficacia dell’Imatinib in associazione alla chemioterapia intensiva. La valutazione avviene secondo uno schema randomizzato nei pazienti con buona risposta alla prefate con steroidi, mentre Imatinib è somministrato a tutti i pazienti con scarsa risposta. Lo studio prevede la valutazione della MRM come marcatore surrogato della risposta ai farmaci nei diversi bracci, consentendo anche di rispondere alla domanda di ricerca “Perché pazienti con la stessa lesione genetica si comportano in modo così eterogeneo ?”. Complessivamente, l’arruolamento atteso è di circa 50 pazienti/anno.

Procedure sperimentali comuni:
Gli stessi approcci saranno applicati ed integrati per tutti i pazienti:
- SNP arrays sul genoma intero per identificare LOH e variazione del numero di copie di geni;
- Analisi di espressione genica tramite microarrays a oligonucleotide;
- Profilo di microRNA utilizzando la nuova generazione di microarray per analisi di microRNA;
- Profilo di segnale delle fosfoproteine in singola cellula tramite citometria a flusso;
- I profili ottenuti dalle analisi di microarray e di microRNA saranno confrontati ai risultati prodotti dall’analisi tramite SNP, allo scopo di associare alterazioni genomiche a profili alterati di espressione genica o di microRNA, per identificare ulteriormente geni differenzialmente espressi con significato biologico e prognostico.
- Alterazioni del profilo di fosforilazione cellulare in seguito ad esposizione a farmaci terapeutici potrebbero indicare quali nodi delle vie di segnale sono alterati dal farmaco, correlandoli a lesioni genomiche.
- Geni e microRNA contenuti in regioni minime di anormalità saranno poi ulteriormente caratterizzati con studi funzionali.

Programmazione dettagliata:
a) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Arrays
L’analisi del DNA sarà effettuata con GeneChip® Human Mapping 100K Array Set (Affymetrix), che consentono l’analisi di oltre 100.00 SNPs su due arrays, con una distanza media tra una marker e l’altro di 23.6 kb. Il protocollo di mappatura GeneChip (Affymetrix) sarà seguito per la preparazione del sonde a DNA. Saranno impiegati la Stazione Fluidica Affymetrix 450/250 e lo scanner GeneChip® Scanner 3000 (Consorzio Genopolis, Università di Milano-Bicocca).
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 3 a 15 del progetto.
b) Arrays di espressione genica
Utilizzeremo i microarray Affymetrix HG-U133® Plus 2.0 oligonucleotide microarrays. Il gruppo della Dr. Kronnie e del Prof. Basso (Università di Padova) partecipa ad un grande studio cooperativo internazionale (Microarray Innovations in Leukemia, MILE), il cui obiettivo è quello di definire profili d’espressione tipici della leucemia in pazienti adulti e pediatrici. In questo contesto, potremo beneficiare della disponibilità di dati di geni differenzialmente espressi derivati da centinaia di campioni del protocollo AIEOP-BFM ALL2000, inclusi casi appartenenti alle classi di rischio descritte precedentemente. A Padova, verranno eseguite sia le ibridizzazioni dei chip che le analisi statistiche.
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 3 a 15 del progetto.
c) Profili di microRNA.
I microRNA (miRNA), un’abbondante classe di RNA regolatori di 22-nucleotidi che controllano l’espressione genica a livello post-trascrizionale, sono stati implicati come aventi un ruolo nell’ematopoiesi normale e nella patogenesi delle leucemie. Dati preliminari nella leucemia (da parte del DR. Chen Z-C, Università di Stanford) indicano che una sistematica analisi di clonaggio dei miRNA può facilitare la scoperta di innumerevoli miRNA specifici della leucemia. Risultati nell’ambito della leucemia con riarrangiamento del gene MLL hanno dimostrato che l’espressione di geni codificanti per i miRNA differisce in sottogruppi affetti da LLA differenti per genetica e prognosi, rispetto a cellule progenitrici CD34+.
Saranno analizzati i candidati miRNA differenzialmente espressi. Utilizzeremo le card Applied Biosystems, sistemi commerciali di PCR quantitativa per tutti i microRNA noti e depositati presso il registro del centro Sanger, progressivamente aggiornato.
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 3 a 15 del progetto.
d) Profilo di single cellule nella Leucemia Linfoblastica Acuta tramite Citometria a Flusso
Le tecniche d’analisi multiparametrica di citometria a flusso consentono di quantificare contemporaneamente molteplici caratteristiche di singole cellule, inclusa la risposta di fosforilazione proteica a stimoli ambientali. Il confronto di reti di segnali di fosforilazione a livello di una singola cellula nell’ambito di pazienti leucemici può essere impiegato per identificare modelli associati alla risposta terapeutica e all’esito clinico; in particolare vorremmo valutare in vitro i profili di fosforilazione dei membri della famiglia delle proteine jak-stats, quali le fosfo-proteine p38 ed Erk1/2 in cellule primarie di leucemia derivate da campioni alla diagnosi di pazienti SR ed HR, stimolate con diversi fattori quali IL-2, IL-3, IL-7, IL-10, IL15, IFN-g, FLT-3L singolarmente o in presenza di farmaci inclusi nello schema terapeutico di induzione alla remissione. La mappa delle reti di segnali coinvolti nelle cellule leucemiche in seguito ad uno stimolo congiunto al trattamento con agenti terapeutici sarà confrontata con i risultati ottenuti in cellule trattate solo con lo stimolo.
Le alterazioni dei profili di segnale delle cellule in seguito all’esposizione ad un agente terapeutico potrebbero indicare quali nodi delle vie di segnale sono coinvolti dal farmaco. I profili di segnale, determinati come descritto precedentemente, potrebbero rappresentare una nuova categoria di biomarcatori nella LLA e queste informazioni potrebbero contribuire a comprendere i meccanismi della resistenza ai farmaci e quindi potenzialmente aprire nuove prospettive alle terapie mirate nel trattamento della leucemia.
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 3 a 15 del progetto.
e) Analisi di validazione
Numerosi metodi saranno impiegati per confermare e approfondire le anormalità identificate, incluse l’analisi FISH e di microsatelliti (per ottenenere ulteriore conferma dei dati e per eventualmente identificare l’origine parentale delle regioni cromosomiche di UPD), analisi western blotting e di citometria a flusso. Inoltre, le tecniche di RQ-PCR e/o immunofenotipo saranno utilizzate per confermare e quantificare le anormalità osservate sull’espressione di geni o microRNA.
Ottenibile in 9 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 9 a 18 del progetto.
f) Integrazione dei dati ottenuti dalla genotipizzazione, dall’analisi di espressione genica e di microRNA, in pazienti pediatrici affetti da LAL a fenotipo B o T, in sottogruppi definiti sulla base della Malattia Minima Residua.
Saranno condotte analisi supervisionate dei dati di SNP array, microRNA e espressione genica al fine di determinare gruppi gerarchici. I pazienti saranno raggruppati in classi differenti basate sulla presenza o assenza di delezioni/amplificazioni ricorrenti o sulla base dell’espressione relativa di microRNA.
Inoltre sugli stessi pazienti, saranno portate a termine analisi dei dati di espressioni genica guidate dai risultati degli SNP o dei microRNA. Allo scopo di identificare i geni significativi tra le diverse classi, verranno eseguite molteplici permutazioni di classi, usando il metodo del t test. I valori del parametro t e i corrispondenti valori P saranno calcolati secondo metodi standard.
Inoltre, valuteremo se le alterazioni del profilo dei segnali di fosforilazione delle cellule, in conseguenza all’esposizione ad agenti terapeutici, possano indicare quali nodi del segnale sono coinvolti dal farmaco, e quindi potenzialmente correlati a lesioni del genoma.
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 12 a 24 del progetto.
g) Analisi funzionali
Siamo molto interessati nella messa a punto di esperimenti funzionali, i quali saranno valutati in accordo con le anormalità trovate.
Ottenibile in 12 mesi. Tempistica complessiva: mesi da 12 a 24 del progetto.

Risultati preliminari:
Con SNP array abbiamo distinto la progressione tumorale in pazienti pediatrici di AML positivi per la mutazione FLT3-ITD, dimostrando che l’UPD era responsabile dell’omozigosità acquisita dell’allele mutato, e altre anormalità nascoste sono state identificate in corrispondenza delle ricadute di AML (Bungaro et al.). Abbiamo descritto che gemelli con traslocazione t(12;21), affetti da LAL, erano portatori di una UPD congenita di una regione interstiziale del cromosoma 2, insieme a distinte anomalie, indicando un’indipendente evoluzione clonale in seguito ad un’origine comune pre-natale (Bungaro et al.). L’integrazione di SNP ed espressione genica in una serie di pazienti pediatrici affetti da LLA senza anormalità note ha permesso di identificare nuovi geni bersaglio di delezioni associate al tumore (Bungaro et al., lavoro sottomesso per pubblicazione).
Risultati attesi:
Dall’integrazione di tutti i dati genomici ci aspettiamo: i) di rilevare direttamente la variazione dei livelli di trascritti/microRNA in regioni delete o amplificate, e ii) di identificare variazioni nell’espressione genica di geni indirettamente colpiti da alterazioni genomiche ricorrenti o dall’espressione differenziale di microRNA. Alterazioni delle vie di segnale delle cellule a seguito dell’esposizione a farmaci terapeutici potrebbero indicare quali molecole sono colpite dal farmaco. Queste potrebbero rappresentare una nuova categoria di biomarcatori nelle LAL e tali informazioni potrebbero contribuire alla comprensione dei meccanismi di resistenza ai farmaci, aprendo potenzialmente nuove prospettive verso terapie più mirate per le leucemie.
Ci aspettiamo di identificare nuovi marcatori genetici per meglio stratificare i pazienti in più definiti gruppi di rischio, così da poter potenzialmente identificare nuovi sottogruppi con specifico rischio di ricaduta clinica e nuovi geni candidati per specifiche nuove terapie.