RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

BIOMONITORAGGIO DI AMBIENTI MARINI COSTIERI: SVILUPPO E APPLICAZIONE DI NUOVE METODOLOGIE CITOCHIMICHE E MOLECOLARI INTEGRATE

Università di riferimento

Università degli Studi di MESSINA - BIOLOGIA ANIMALE ED ECOLOGIA MARINA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Salvatore Fasulo

Descrizione

Le condizioni ambientali non idonee si ripercuotono sugli organismi animali, determinando alterazioni di vario tipo. Infatti, gli inquinanti inducono modificazioni strutturali, alterano l'omeostasi del calcio e compromettono la funzionalità di sistemi enzimatici che controllano la neurotrasmissione e il trasporto transepiteliale di ioni nei tessuti più esposti a tale rischio come l'epitelio respiratorio, l'epatopancreas, il fegato, l'encefalo e l'urofisi. La ricerca, strettamente integrata con le altre U.O. sarà orientata al monitoraggio in alcune aree costiere della Sicilia orientale dove è nota la presenza di inquinamento di tipo antropico e/o di tipo industriale.
La realizzazione del progetto prevede fasi preliminari tendenti a selezionare quelle aree costiere, tra le diverse prese in considerazione (Golfo di Augusta, Priolo, (SR), Golfo di Milazzo, ME) suscettibili di un'indagine conoscitiva integrata sullo stato di contaminazione e sul livello potenziale di impatto sulla rete alimentare. Per queste aree verranno formulate le ipotesi di azione dei diversi contaminanti ai vari livelli delle biocenosi bentoniche e verrà, successivamente, verificato in campo il modello di distribuzione attraverso analisi in vivo dei livelli di bioaccumulo in organismi rappresentativi. L'area che risulterà più idonea, sia per i livelli di qualità ambientale che per la rappresentatività dei modelli ecotossicologici, verrà selezionata per gli approfondimenti successivi.
Saranno, identificate le specie che, in relazione alle esigenze fisiologiche ed alla nicchia trofica occupata, presentano valori di alterazione morfo-funzionale elevati ed “anomali” rispetto ai campionamenti effettuati in aree di controllo. Queste ultime saranno individuate in base a caratteristiche ecologiche simili ma con minimo livello di antropizzazione, quali l’Isola delle Correnti (SR), la riserva naturale di Vendicari ( SR), la riserva naturale di Marinello (ME). Anche sulla comunità bentonica di queste aree saranno esaminati i parametri ecologici rilevanti già individuati. I dati ottenuti forniranno una misura della biodisponibilità ambientale degli inquinanti e dei processi di biomagnificazione nella rete trofica.
Saranno inoltre utilizzati i Mitili in qualità di ottimi organismi sentinella che grazie alla loro caratteristica di accumulare nei propri tessuti diversi tipi di inquinanti organici ed inorganici presenti nell’ambiente, possono essere utilizzati per la valutazione di diversi biomarkers di stress nell’ambiente marino costiero. A tal proposito, nei diversi siti di controllo e potenzialmente contaminati saranno messi a stabulare in gabbie sommerse alla medesima profondità (circa 6 metri) lotti di mitili che presentino caratteristiche simili in termini di età degli individui e stato riproduttivo al fine di una corretta interpretazione analitica dei risultati.
Una fase importante del programma di ricerca è rappresentata dalle osservazioni e correlazioni della struttura di base degli organi prelevati dagli individui, provenienti dai diversi ambienti e l’uso di indici di stress (metallotioneine, sostanze bioattive, come ossido di azoto ed endoteline, neurotrasmettitori, heat shock proteins, aquaporine, proteine che regolano il turnover cellulare) per la valutazione dell'effetto di sostanze xenobiotiche sugli individui esaminati.
Il gruppo di ricerca, che in questi ultimi anni ha acquisito notevole esperienza nel biomonitoraggio di ambienti costieri e salmastri grazie al completamento di significativi progetti di ricerca anche di interesse nazionale (finanziati con fondi Prin, PRA, MEMOBIOMAR, Arpa Sicilia) si propone, con ulteriori studi interdisciplinari ed al fine di accrescere le conoscenze in merito, di individuare precocemente gli effetti delle alterazioni indotte da inquinamento ambientale in organismi acquatici, tramite l'applicazione di una serie di indici ecologici e di indici di stress di tipo biomolecolare, istologico, istomorfologico e immunoistochimico. Ciò consentirà di ottimizzare l'approccio metodologico basato sull'utilizzo di alcune molecole, considerate "Biomarker" nelle comunità bentoniche costiere al fine di fornire indicazioni sullo stato di salute degli ambienti presi in considerazione.
Questi dati forniranno ulteriori validi tests, diagnostici e prognostici, sul rischio di patologie cui gli organismi vanno incontro se sottoposti a stress ambientali. Attraverso l'individuazione delle risposte immediate sarà possibile prevedere il verificarsi di effetti negativi a medio e lungo termine sugli organismi animali direttamente interessati (variazione dell'espressione genica di alcune molecole coinvolte nella detossificazione cellulare o nell'equilibrio elettrolitico, attivazione o inibizione di sistemi nervosi periferici, bioaccumulo, inibizione dei meccanismi dell'omeostasi tissutali, come processi di apoptosi o proliferazione cellulare, o dei meccanismi di omeostasi del calcio e di altri elettroliti ) e sulla successiva rete trofica che giunge fino all'uomo.

Descrizione delle attività della ricerca
Scopo del progetto è di individuare il grado ed il tipo di alterazioni provocati dall'inquinamento, in organismi acquatici, considerati bioindicatori, tramite l'utilizzo di alcuni indici di stress di tipo biomolecolare ed immunoistochimico. Gli organismi marini che vivono in ambienti costieri, sottoposti a diverse fonti di accumulo presentano nei loro organi e tessuti, danni morfologici e funzionali di entità variabile in relazione al tipo di inquinamento che alla concentrazione e durata di esposizione. Infatti, l'esposizione ad inquinanti, può alterare il trasporto di membrana, le interazioni tra le proteine del citoscheletro, la neurotrasmissione, provocando danni istomorfologici e funzionali nei tessuti più esposti a tale rischio come l'epitelio respiratorio, il fegato, l'encefalo, organi sensoriali.
Il programma sarà articolato in due fasi:
La prima fase (16 mesi) sarà distinta in due momenti: nel primo momento (della durata di 4 mesi) propedeutico ed integrato con le attività iniziali di tutte le altre U.O., verrà determinato l'insieme dei parametri ambientali caratterizzanti delle aree geografiche sopraindicate, effettuando, in contemporanea, un primo monitoraggio per individuare la fauna ittica bentonica più idonea e significativa per l'indagine (come ad esempio gli Scorpenidi e i Blennidi) che presenti caratteristiche tipiche dei biondicatori e sia ampiamente diffusa nell'ambiente costiero. Nel secondo momento, della durata di 12 mesi, saranno effettuati, in periodi diversi, le indagini ambientali ed i campionamenti biologici nell'ambiente costiero. Parallelamente si procederà negli ambienti di controllo, seguendo il medesimo protocollo sperimentale, con il prelievo degli individui di confronto appartenenti alle stesse specie.
La seconda fase (8 mesi) consisterà nella correlazione dei dati ottenuti nella fase precedente con quelli conseguenti dalle altre Unità Operative.
In particolare saranno eseguite osservazioni e campionamenti "in situ" per descrivere le caratteristiche e la struttura degli ecosistemi, prelievo di tessuti ed organi, di tutti gli individui provenienti anche dalle altre U.O., ed esame istomorfologico su branchie, fegato, cervello ed urofisi dei Teleostei,mentre per quanto riguarda i Bivalvi, solo su branchie e ghiandola digestiva.
Sono previsti almeno due campionamenti per anno, uno durante le stagioni riproduttive ed un secondo in periodo di riposo.
Su tutti gli organi, opportunamente prelevati, fissati e/o congelati, appartenenti ad individui provenienti dagli ambienti risultati più idonei per la ricerca, saranno eseguite le seguenti analisi:
-Esame istomorfologico.
-Analisi immunoistochimica (immuniperossidasi, immunofluorescenza) dei modelli di distribuzione di proteine citoscheletriche e di proteine leganti calcio che subiscono notevoli alterazioni in rapporto alla presenza dei metalli pesanti; di componenti bioattive come l'enzima NOS, presente nelle tre forme: neuronale (n-NOS), inducibile (i-NOS) ed endoteliale (e-NOS), la cui espressione sembra essere influenzata da stress causato da inquinamento; le heat shock proteins che costituiscono una famiglia di proteine ubiquitarie attivata da stress termico e da numerosi altri fattori come stress osmotico, ossidativo e presenza di metalli pesanti; le aquaporine; le metallotioneine, il citocromo P450, che svolge un ruolo chiave nei processi iniziali della detossificazione di composti xenobiotici, in particolare idrocarburi; l’urotensina, la cui sintesi da parte delle cellule neurosecernenti del sistema neurosecretore caudale è fortemente influenzata dalle variazioni dell’ambiente esterno.
-Analisi immunoistochimica delle alterazioni nucleari, per valutare l'entità dei fenomeni di apoptosi (Tecnica TUNEL) e proliferativi (PCNA) e loro incidenza sul ciclo cellulare
– Valutazione della stabilità delle membrane lisosomiali. L’esposizione ad agenti inquinanti, nonché condizioni fisiologiche di stress non legate a fattori esogeni e condizioni di forte anossia e ipertermia, sono in grado di ridurre l’integrità della membrana dei lisosomi. Pertanto la loro stabilità può essere considerata un ottimo biomarker di stress e si può misurare sperimentalmente osservando il tempo di permeabilizzazione delle membrane ad un determinato substrato tramite “lysosomal neutral red retention”.
-Analisi di tipo biomolecolare: cervello, branchie, fegato e ghiandola digestiva degli organismi bioindicatori, verranno prelevati ed utilizzati per l'estrazione dell'RNA. I cDNAs corrispondenti ai frammenti genici in esame verranno amplificati mediante PCR con l'utilizzo di primers specifici costruiti sulle sequenze nucleotidiche presenti in banca dati per i geni noti, oppure sulle sequenze nucleotidiche ottenute mediante programma BLAST (GenBank, NCBI) per i geni non ancora noti. L'identità del frammento verrà confermata dal sequenziamento. Sintetizzando inoltre delle sonde si potrà effettuare una ibridazione in situ su sezioni istologiche per determinare la distribuzione dei trascritti direttamente nel tessuto. A questi dati preliminari di tipo qualitativo verranno affiancate analisi di tipo quantitativo mediante impiego di Real Time PCR per quantificare l'espressione dei singoli geni delle metallotioneine, delle tre isoforme dell'enzima NOS, delle heat shock proteins, e delle aquaporine,
-Valutazione del grado di danneggiamento del DNA con individuazione di biomarkers specifici.
-Confronto dei dati con quelli rilevati in individui, della stessa specie, viventi in ambienti non inquinati.
-Valutazione dei danni al DNA attraverso l'utilizzo della COMET. Tale tecnica si è rivelata particolarmente adatta come test di biomonitoraggio ambientale in quanto permette di esaminare gli eventi di rottura del filamento di DNA (singolo o doppio) quali biomarkers per evidenziare la presenza di inquinanti genotossici nell'ambiente. Per i mitili, viene utilizzata l'emolinfa. I danni potenziali osservati mediante Comet assay vengono confermati dal test dei micronuclei che valuta la presenza di danni al DNA a livello cromosomico.
-Analisi spettrofotometriche e spettrofluorimetriche su epatopancreas, fegato ed encefalo al fine di individuare alcune attività enzimatiche da validare come biomarkers metabolici e cellulari (monoossigenasi a funzione mista: EROD; BPNO; IPA; ed esterasi: ACh E.; BChE) per valutare l'effetto dell'esposizione ad agenti neurotossici, composti xenobiotici liposolubili ed interazioni con metalli pesanti.
-Elaborazione statistica uni- e multi-variata per la definizione di modelli di simulazione e di validazione dei risultati ottenuti. mediante l'utilizzo dei tests t-student's e U-Mann Withney. dei metodi ANOVA e PCA.

Risultati attesi
Il progetto tende ad approfondire gli aspetti ecofisiologici di specie esposte a vari tipi di impatto dovuti a, scarichi industriali/urbani, aree portuali, attività antropiche, ed a stimare, per via biologica, il livello di inquinamento di aree marine.Tende inoltre alla definizione degli effetti citotossici dell'inquinamento sull'epitelio branchiale di tutti gli organismi sentinella presi in esame ed in particolare sui tipi cellulari specializzati come gli elementi paraneuronali.
I dati forniti dall'indagine biomolecolare sugli organi presi in esame di individui sottoposti a stress naturale e/o indotto (mitili trattati dall'UO di GE), potrebbero evidenziare una diversa espressione dei geni delle metallotioneine, NOS, aquaporine e heat shock proteins, rispetto agli esemplari di controllo. Il rilevamento degli effetti di contaminanti sul DNA, sia in termini di mutazioni cromosomiche che di rottura del filamento di DNA (singolo o doppio) fornirà l'entita del danno genotossico attribuibile ai contaminanti presenti.
Tali risultati permetteranno di elaborare un modello relativamente ai processi di esposizione-effetto dei metalli pesanti nelle specie considerate. Tale modello oltre a fornire delle informazioni peculiari, consentirà, nella fase successiva dello studio in natura, una migliore interpretazione dei risultati ottenuti. Tali studi consentiranno di evidenziare i livelli di bioaccumulo dei metalli negli organismi campionati fornendo una misura della loro biodisponibilità ambientale. Da quest'ultimo aspetto dipendono i successivi processi di interferenza al livello delle attività enzimatiche studiate. La sintesi di queste informazioni fornirà il dato finale sullo stato di contaminazione dell'area.

La seconda fase (durata 8 mesi) comprenderà un'integrazione dei dati con quelli raccolti dalle altre unità operative che utilizzeranno modelli metodologici diversi; ciò consentirà di selezionare le risposte molecolari e cellulari al fine di analizzare i meccanismi di azione per la messa a punto di biomarkers più rapidamente sensibili all'inquinamento ambientale.

Si ritiene che tale progetto, complesso ed articolato, permetterà di valutare precocemente, lo stato di inquinamento biologico ed il rischio tossicologico dei composti inquinanti sugli organismi marini attraverso un approccio originale basato sulla valutazione delle risposte fisiologiche che gli organismi mettono in atto nei confronti di uno stress ambientale. Ciò permetterà di identificare lo stato qualitativo dell'ambiente e gli interventi più idonei per la sua tutela.