RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

BIOMONITORAGGIO DI AMBIENTI MARINI COSTIERI: SVILUPPO E APPLICAZIONE DI NUOVE METODOLOGIE CITOCHIMICHE E MOLECOLARI INTEGRATE

Università di riferimento

Università degli Studi di GENOVA - BIOLOGIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Laura Canesi

Descrizione

Il progetto si propone di studiare gli effetti dello stress indotto da inquinanti ambientali su un organismo modello, il mitilo (Mytilus spp), utilizzando un approccio integrato biomarkers/genomica/proteomica. I mitili, molluschi bivalvi, sessili e filtratori, sono in grado di accumulare nei propri tessuti diverse classi di inquinanti organici ed inorganici presenti nell'ambiente. Pertanto essi rappresentano gli organismi sentinella più utilizzati nei programmi di biomonitoraggio per la valutazione di diversi biomarker di stress ambientale nell'ambiente marino costiero. Sebbene numerosi studi siano stati realizzati allo scopo di valutare gli effetti delle diverse classi di inquinanti su particolari funzioni cellulari e su singole proteine, manca ad oggi uno studio organico mirato ad evidenziare gli effetti ed i meccanismi di azione di diverse classi di inquinanti a livello di espressione genica e proteica. L’UO di GE si propone pertanto di studiare gli effetti dello stress indotto da inquinanti ambientali sul mitilo, utilizzando un approccio integrato biomarkers/genomica/proteomica.
In particolare, la ricerca prevede la valutazione degli effetti di inquinanti organici considerati potenziali distruttori endocrini o EDC ad azione estrogenica o antiestrogenica quali alchilfenoli, bifenili policlorurati, pesticidi, etc. Tale studio risulta di particolare importanza poiché, mentre per molti di questi inquinanti gli effetti sul sistema endocrino dei vertebrati sono noti, il problema dell'identificazione di biomarker di distruzione endocrina negli invertebrati rimane tuttora aperto (Ohelmann J, Schulte-Ohelmann U, 2003. Endocrine disruption in invertebrates. Pure Appl Chem 75:2207-2218; Gagnè F, Blaise C, Hellou J, 2004. Endocrine disruption and health effects of caged mussels, Elliptio complanata, placed downstream from a primary-treated municipal effluent plume for 1 year. Comp Biochem Physiol.. 138C:33-44; Ortiz-Zarragoitia M, Cajaraville MP, 2006. Biomarkers of exposure and reproduction-related effects in mussels exposed to endocrine disruptors. Arch Environ Contam Toxicol 50:361-369; Porte, C., Janer, G., Lorusso, L.C., Ortiz-Zarragoitia, M., Cajaraville, M.P., Fossi, M.C., Canesi, L., 2006. Endocrine Disruptors in marine organisms: approaches and perspectives, Comp. Biochem. Physiol., 143C:303-315). A questo scopo, verranno svolti approfonditi studi sugli effetti di potenziali modelli di EDC sulla espressione genica e proteica nei tessuti del mitilo, e i risultati confrontati con i dati ottenuti dalla valutazione dei biomarker.
In un primo tempo verranno condotti esperimenti di esposizione di mitili in laboratorio a sostanze organiche selezionate come modelli di potenziali distruttori endocrini (EDC) e ad inquinanti inorganici quali i metalli pesanti (in particolare il Cromo) e loro miscele. Nella seconda fase verranno utilizzati mitili campionati in diverse aree marine costiere sottoposte a forte impatto antropico sia urbano che industriale, caratterizzate dalla presenza di diverse classi di inquinanti (quali IPA, metalli pesanti, potenziali distruttori endocrini, etc) e di controllo.

Ricerca in laboratorio:
I mitili verranno esposti a diverse concentrazioni di modelli di inquinanti organici noti come EDC (alchilfenoli, quali ad es. Bisfenolo A-BPA) o sospettati di agire come EDC nei Vertebrati (pesticidi quali ad es. cloropirifos), per diversi periodi di tempo (da 1 a 4 giorni). In parallelo, gruppi di mitili verranno esposti a diverse concentrazioni dell’estrogeno naturale 17beta-estradiolo (E2). Set di animali di controllo verranno mantenuti nelle stesse condizioni. Al termine del trattamento i mitili saranno suddivisi per sesso e identificati per stadio riproduttivo; i tessuti (gonadi, branchie, ghiandola digestiva ed emolinfa) verranno prelevati e opportunamente conservati per le diverse analisi. Verranno inoltre valutati gli effetti del Cr, in quanto esso rappresenta il principale contaminante inorganico presente in uno dei siti presi in considerazione per lo studio in campo, sia quale singolo inquinante sia per valutare i possibili effetti additivi, sinergici o antagonisti rispetto all’esposizione di mitili all’E2 e a un tipico distruttore endocrino (BPA).
I campioni verranno analizzati mediante l’utilizzo di una batteria di biomarkers per misurare l’alterazione dello stato di salute degli animali, dal livello cellulare a quello di organismo, in risposta ad agenti stressanti comprendente analisi di tipo biochimico, fisiologico, etc. attualmente impiegate nei programmi di biomonitoraggio ambientale e approvati dalle agenzie internazionali di protezione dell'ambiente UNEP (United Nation Environment Programme) e MAP (Mediterranean Action Plan).
Lo studio degli effetti di EDC e del Cr verrà approfondito utilizzando un approccio genomico. Campioni di RNA di ghiandola digestiva e mantello estratti da animali di controllo e animali esposti alle sostanze prescelte saranno analizzati attraverso ibridazione competitiva su un cDNA microarray ad alta densità messo a punto in precedenza (Venier P, De Pitta C, Pallavicini A, Marsano F, Varotto L, Romualdi C, Dondero F, Viarengo A, Lanfranchi G. 2006. Development of mussel mRNA profiling: Can gene expression trends reveal coastal water pollution? Mutat Res. 602:121-34). Particolare attenzione sarà data al pre-processing dei dati del microarray (controllo di qualità, sottrazione del background, normalizzazione), ed all’analisi statistica –basato su un approccio Baesiano di tipo empirico. Queste operazioni saranno ottenute attraverso l’uso del software Limma [Smyth, G. K. (2005. Limma: linear models for microarray data. In: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry, W. Huber (eds.), Springer, New York, pages 397-420.] in ambiente R (http://www.r-project.org/). Questa procedura complessa e ampiamente standardizzata dai ricercatori del DISAV dell’Università del Piemonte Orientale afferenti alla UO di GE fornirà la lista dei geni Differenzialmente Espressi (DE) per effetto di ciascun trattamento. Un approccio efficace per fornire una interpretazione biologica di questi dati è l’utilizzo dell’ontologia genica (http://www.GeneOntology.com), che consiste in un vocabolario di termini assegnati ad ogni gene DE e che descrivono l’implicazione in determinati “Processi Biologici”, Funzioni Molecolari” e “Localizzazione Cellulare”. La piattaforma bioinformatica Blast2GO (B2G) (Ana Conesa, Stefan Götz, Juan Miguel García-Gómez, Javier Terol, Manuel Talón and Montserrat Robles. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.Bioinformatics 2005 21: 3674-3676) sarà utilizzata per questo scopo. B2G utilizza BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) per trovare sequenze omologhe, quindi il programma estrae tutti i termini GO esistenti associati alle sequenze del BLAST per ottenere una mappatura dell’annotazione. Una regola di annotazione, infine, assegna i termini GO alle sequenze di interesse. L’applicazione offre la possibilità di un’analisi statistica diretta sulla funzione genica. In ultimo B2G visualizza i pathways in cui un gene o gruppi di geni sono coinvolti. L'analisi dei pathways è un approccio interessante all'analisi dei dati del microarray in quanto è virtualmente in grado di fornire indicazione sia sui processi adattativi alle condizioni di stress (esposizione a sostanze tossiche), sia sul destino metabolico delle sostanze, sia sugli effetti tossici indotti.
La quantificazione di specifici trascritti di interesse verrà inoltre valutata mediante RT-PCR quantitativa.
Negli stessi campioni verranno esaminati gli effetti degli inquinanti a livello del proteoma. Inizialmente saranno studiate le proteine citosoliche che, in quanto idrosolubili, meglio si prestano allo studio proteomico mediante mappa bidimensionale. Gli estratti proteici verranno sarà separati su gradiente di pH immobilizzato non lineare di 24 cm (pH 3-10) nella prima dimensione, e in SDS elettroforesi in gel 20x20 cm a concentrazione di monomeri costante. I gel saranno successivamente colorati, o con il reattivo fluorescente Sypro RubyTm (Molecular Probes) (Steimberg et al., 2001, Proteomics 1:841) o con Coomassie Brilliant Blue G-250 (Maohon and Cupree, 2001, Electrophoresis 22:2075). Le mappe bidimensionali ottenute saranno analizzate saranno analizzate con l'uso di software di analisi di immagine dedicati (PD Quest, Bio-Rad), per identificare le proteine differenzialmente espresse. Quindi sarà effettuata l'analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa. Non essendo il genoma del Mitilo completamente sequenziato, per l’identificazione delle proteine isolate non è sufficiente una semplice analisi del profilo di peptidi triptici mediante MALDI-TOF. Si renderà quindi necessario utilizzare una tecnica di spettrometria di massa complessa e raffinata che consiste nel sequenziamento de novo dei digeriti triptici separati in nano cromatografia liquida (LC) e ionizzati su sorgente Electron Spray (ESI). Questa tecnica è anche conosciuta come massa/massa o tandem massa e sfrutta l'analisi di massa mediante un sistema quadripolo-TOF. Dalle sequenze ottenute quindi si tratterà di identificare le proteine mediante confronto in database di proteine specializzati (es. MASCOT) di polipeptidi ortologhi. Uno degli obiettivi dell'analisi proteomica sarà la possibilità di verificare sperimentalmente l’attivazione / inibizione dei pathway dedotti dall'analisi dei microarray. Alcune proteine che risulteranno di particolare interesse per via di notevoli cambiamenti quantitativi o qualitativi, saranno ulteriore oggetto di indagine mediante approcci immunoistologici e immunobiochimici, che prevederanno la realizzazione di anticorpi specifici a partire dalle sequenze aminoacidiche indentificate.
In particolare, verranno verificati i possibili cambiamenti nel contenuto di proteine nell’emolinfa, il liquido circolante dei in un sistema circolatorio aperto, attraverso vasi incompleti e lacune direttamente a contatto con i tessuti. Pertanto, entrando in contatto spesso diretto con i diversi organi, l’emolinfa potrebbe rappresentare il comparto biologico più adatto per evidenziare eventuali alterazioni della fisiologia dei molluschi.
E’ importante sottolineare come sia la lettura dei microarray che le analisi in spettrometria di massa verranno effettuate presso il DISAV dell’Università del Piemonte Orientale, che provvederà inoltre ai costi di funzionamento e parteciperà all’acquisto di parte del materiale di consumo.

Ricerca in campo:
La sperimentazione in campo sui mitili sarà effettuata utilizzando mitili ‘caged’ (Dagnino et al., 2007, Development of an expert system for the integration of biomarker responses in mussels into an animal health index, Biomarkers, 12, 155-172). Mitili di controllo (circa 200 individui) provenienti dall’impianto di stabulazione di La Spezia verranno posti in apposite gabbie posizionate nei siti di interesse e ivi mantenuti per 30 giorni. Alla fine del periodo di esposizione, gli animali verranno campionati in gruppi di 10-12 in sestuplicato, posti in ambiente umidificato e refrigerato e immediatamente portati in laboratorio, dove saranno suddivisi per il sesso, i tessuti verranno prelevati e opportunamente preparati per le diverse analisi e congelati a -80°C. In parallelo, saranno stati precedentemente prelevati campioni da un simile set di animali di controllo. Nei diversi siti di interesse saranno parallelamente eseguiti campionamenti di specie ittiche bentoniche rappresentative di diversi livelli della catena trofica (sia erbivore che carnivore).
Su tali campioni verrà valutata una batteria di biomarker di stress ambientale, comprendente analisi di tipo biochimico e fisiologico: (a) modificazioni istopatologiche della ghiandola digestiva di mitili e del fegato di pesci (in termini di stabilità della membrana lisosomiale, accumulo lisosomiale di lipofuscine etc.); (b) sintesi di proteine citoprotettive (metallotioneine e heat shock proteins); (c) effetti a livello di organismo nei mitili (Stress on Stress response).
In particolare, per quanto riguarda il campionamento nel Mar Ligure, come sito di riferimento verrà utilizzata la stazione di Portofino, identificata da diversi studi precedenti, incluso un progetto cofinanziato dal MIUR (Cofin 2004), come sito non contaminato in base alla valutazione dello stato di salute degli organismi. Come sito contaminato verrà considerato un sito industriale prevalentemente interessato da inquinamento da metalli pesanti, Cr in particolare (area antistante alla ex-Stoppani a Cogoleto-Genova). Anche sui campioni di mitili prelevati in campo saranno effettuate analisi dei profili di espressione genica e proteica.
Inoltre, campioni di tessuti di mitili provenienti dagli studi in campo e in laboratorio verranno analizzati dalla UO di Siena per il contenuto in metalli pesanti.

I risultati ottenuti mediante le analisi di espressione genica e proteica (ad esempio proteine dell’emolinfa), sui campioni ottenuti sia in campo che in laboratorio verranno confrontati con i risultati sullo stato di salute degli organismi forniti dai biomarkers. I campioni verranno analizzati mediante l'utilizzo di una batteria di biomarkers per misurare l'alterazione dello stato di salute degli animali, dal livello cellulare a quello di organismo, in risposta ad agenti stressanti. Queste analisi verranno effettuate in parallelo alla valutazione di altri biomarker da parte delle UO di ME. Nello stesso modo, alcuni biomarker verranno valutati in campioni di pesci e mitili forniti dalla UO di ME provenienti dai siti di controllo e inquinati selezionati da quella Unità. I dati relativi ai biomarkers del mitilo verranno quindi processati mediante un sistema esperto di analisi integrata, sviluppato da alcuni dei ricercatori di questa UO e successivamente validato con dati di esperimenti sia in campo che in laboratorio (Dagnino et al., 2007).
La presente ricerca dovrebbe portare ad identificare nuove proteine coinvolte nella risposta a interferenti endocrini EDC e, pertanto, ad evidenziare un pattern proteico tipico della risposta ad un particolare inquinante (o classe di inquinanti). I dati ottenuti permetteranno di valutare quantitativamente se ai cambiamenti nell'espressione genica corrispondono variazioni nella concentrazione delle corrispondenti proteine e di avviare ricerche più approfondite sul possibile ruolo biologico delle proteine identificate. I dati raccolti permetteranno la messa a punto di adeguate sonde per RT-PCR quantitativa per dare una corretta valutazione circa le variazioni quantitative di alcuni mRNA del DNA microarray. Le indagini relative alla analisi genomica e proteomica contribuiranno alla identificazione di nuove proteine e/o trascritti coinvolti nella risposta allo stress; i dati ottenuti verranno associati a quelli relativi alle alterazioni della batteria di biomarker.
L'integrazione dei dati consentirà di correlare l'evoluzione dell'alterazione dei profili di espressione genica e proteica con la risposta adattativa degli organismi alle variazioni ambientali valutata a livello cellulare, tissutale ed organismico. I dati ottenuti dai campioni prelevati in campo permetteranno di identificare specifiche risposte a particolari classi di inquinanti. I dati ottenuti dagli esperimenti in laboratorio permetteranno l'identificazione di bersagli molecolari di distruttori endocrini in confronto a quelli dell'estrogeno naturale. Questi risultati forniranno informazioni chiave per la valutazione degli effetti di sostanze inquinanti ad azione estrogenica/antiestrogenica in bivalvi marini e permetteranno lo sviluppo di biomarker specifici di distruzione endocrina.