RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

BIOMONITORAGGIO DI AMBIENTI MARINI COSTIERI: SVILUPPO E APPLICAZIONE DI NUOVE METODOLOGIE CITOCHIMICHE E MOLECOLARI INTEGRATE

Università di riferimento

Università degli Studi di SIENA - SCIENZE AMBIENTALI - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Claudio Leonzio

Descrizione

Il presente progetto si propone di utilizzare un approccio metodologico basato sull’uso di organismi come biomonitor per indagare i livelli di accumulo e le risposte biochimiche e metaboliche che gli organismi producono in presenza di metalli pesanti nell’ambiente in cui vivono. Gli strumenti metodologici utilizzati sono rappresentati dall’utilizzo di organismi quali bioindicatori e da una serie di parametri da valutare su questi, quali “indicatori sensibili” della presenza e degli effetti dei metalli nell’ambiente. L’area di studio sarà rappresentata da due ambienti sottoposti a forte impatto ecotossicologico per la presenza di impianti industriali. Le aree sono situate in Sicilia (Baia di Augusta) e in Liguria (Stoppani). Nei due distretti geografici saranno selezionate anche due aree di controllo il più possibile simili, per caratteristiche ecologiche, agli ambienti impattati. Gli organismi indicatori saranno selezionati in funzione del livello trofico: filtratori (molluschi bivalvi), erbivori e predatori (pesci).
I principali vantaggi nell’impiego di molluschi bivalvi in programmi di biomonitoraggio, sono soprattutto la conoscenza del loro ciclo biologico, delle abitudini alimentari, la facilità di raccolta e l’ampia diffusione geografica. Nonostante la realizzazione da parte del Ministero dell’Ambiente della banca dati Sistema Difesa del Mare (Si.Di.Mar.) per il “Programma di Monitoraggio per il controllo dell’Ambiente Marino”, il numero delle informazioni relative alla presenza di metalli pesanti e composti organoclorurati negli ambienti marini costieri risulta sempre estremamente limitato sia per la bassa densità di siti di campionamento, che per l’esclusione della valutazione degli effetti che tali contaminanti possono produrre.
Anche molte specie di pesci sono stati ampiamente utilizzati per programmi di biomonitoraggio. Nel presente studio specie di pesci erbivori (es salpe) e carnivori (es scorpenidi o serranidi) sono il complemento indispensabile per caratterizzare la rete trofica ed i processi di trasferimento dei contaminanti nei vari livelli.

L'unità operativa di Siena si integra nel progetto attraverso una serie di azioni fondamentali che vengono elencate di seguito:.
a. supporto analitico per tutte le analisi dei metalli pesanti nei campioni forniti dalle altre unità;
b. analisi delle porfirine epatiche quale biomarker di esposizione nei campioni di pesci di tutte le aree di studio
c. valutazione del danno sul DNA attraverso l’analisi dei micronuclei in campioni selezionati delle aree di studio.
.d. valutazione complessiva degli impatti e del pericolo potenziale delle aree investigate

Per la realizzazione del progetto saranno necessarie diverse fasi operative che vengono di seguito descritte.

1. Scelta dei siti: valutazioni preliminari sulle metodologie di indagine

Saranno realizzati screening per la caratterizzazione delle aree di studio. Questa fase risulterà particolarmente importante per la scelta delle stazioni di controllo. Queste ultime saranno selezionate per le caratteristiche ecologiche che dovranno essere simili a quelle delle aree impattate.

2.Analisi degli indicatori di esposizione, di effetto e di danno
Determinazione dei livelli di bioaccumulo di metalli in organi e tessuti.
Campioni di organi e tessuti saranno mineralizzate tramite digestione in “bomba” di teflon (Stoeppler e Bakhaus, 1978). Sulle soluzioni ottenute si effettueranno le analisi dei metalli. In ogni serie di analisi sarà inserita una prova del bianco (blank) per poter verificare la purezza dei reagenti e una serie di prove su materiali di riferimento con concentrazioni certificate per verificare il grado di accuratezza delle analisi.
Sarà utilizzato uno spettrofotometro ad assorbimento atomico Perkin Elmer FIMS 400 con la tecnica del vapore freddo per l’analisi del mercurio; uno spettrofotometro ad assorbimento atomico Perkin Elmer Analyst 700 con atomizzazione mediante fornetto di grafite per l’analisi di Cd, Pb, Cr, Ni; uno spettrofotometro ad assorbimento atomico Perkin Elmer
Zeeman 4100 accoppiato al Perkin Elmer Fias 100 per la tecnica della generazione degli idruri utilizzata per l’analisi di As e Se; uno spettrometro ad Emissione Plasma ICP/OES Perkin Emer Optima 5300 DV per la determinazione di Zn, Cu, Fe, Mn.


• Analisi dei livelli delle porfirine epatiche
Per l’analisi delle porfirine su campioni di fegato e verrà utilizzato il metodo spettrofluorimetrico di Grandchamp et al.(1980). Questo metodo consente di misurare le concentrazioni delle uroporfirine, coproporfirine e protoporfirine in un estratto di porfirine nel range nanomolare. Per l’estrazione delle porfirine dal fegato vengono utilizzati circa 200 mg di tessuto, omogeneizzati in distillata con un Ultra-Turrax In seguito 200 ml di ciascun campione viene trasferito in provette da centrifuga insieme con 1,6 ml di una soluzione metanolo/acido perclorico 1N 50:50 ed agitati in Vortex per 4 passaggi di 10 sec ciascuno. I campioni così trattati vengono lasciati al buio per 10 min, quindi centrifugati ad un basso numero di giri. Il sovranatante ottenuto dalla centrifugazione è pronto per la lettura fluorimetrica.

• Valutazione del danno sul DNA (micronuclei)
Questo test è un indice specifico della presenza di sostanze con attività genotossica come idrocarburi aromatici policiclici e metalli pesanti. Dopo l’esecuzione dello striscio di sangue, il vetrino viene fissato con il fissativo di Carnoy e colorato con Giemsa al 5%. Al microscopio, per ogni vetrino vengono lette 2000 cellule, determinando la frequenza dei micronuclei presenti (Countryman & Heddle, 1976).

3. Valutazione del livello di impatto
I dati relativi ai livelli di bioaccumulo dei metalli negli organismi campionati forniranno una misura della biodisponibilità Con i dati relativi all'accumulo delle porfirine ed il test dei micronuclei sarà possibile la valutazione del danno sul metabolismo dell'eme ed il danno sul DNA.
La sintesi di queste informazioni insieme alla comparazione dello status delle specie esaminate rispetto all’area di controllo fornirà il dato finale sullo stato di contaminazione dell’area.
Sarà quindi possibile definire un quadro della situazione ambientale attraverso la quantificazione dell’impatto sulle comunità bentoniche e formulare un’ipotesi di pericolo potenziale e di rischio sulle comunità umane che usano organismi dell’area come alimento.