RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Amiloidi e ripiegamento di proteine: un approccio teorico-sperimentale

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - FISICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Amos Maritan

Descrizione

Questo progetto e' organizzato su quattro divere linee principali di ricerca

1) Solvatazione di proteine

Argomenti di simmetria giocano spesso un ruolo importante nel
determinare la natura dell'ordine di un sistema[LL 1958]. Un insieme
di sfere dure mostra sia una fase fluida (isotropica) che una
cristallina delimitate da una transizione di primo ordine determinata
dalla variazione del parametri di impacchettamento. Per generalizzare
il problema delle sfere dure ad oggetti unidimensionali si dovrebbe
considerare una linea od una corda con uno spazio proprio associato ad
ogni punto lungo la linea. Questo porta ad un modello di tubo con
spessore uniforme, centrato attorno alla linea[MFTBM 2005]. Si puo'
visualizzare il tubo come il limite continuo di una catena discreta di
dischi, o monete, concatenati e di raggio fissato, separati tra di
loro da una distanza che tende a zero nel limite continuo. Una
descrizione alternativa di una molecola lineare e' quella a "palle e
corde" ove gli oggetti concatenati sono invece sfere. La differenza
fondamentale fra queste due descrizioni consiste nella differente
geometria degli oggetti che sono legati tra loro. Se si compatta una
catena di sfere, ogni sfera individualmente tende a circondarsi
isotropicamente con altre sfere, mentre nel caso del modello a tubo ci
sono segmenti di tubo che cercano di orientarsi parallelamente tra di
loro. Il polimero a tubo mostra una fase marginalmente compatta
localizzata tra la fase aperta e quella compatta isotropica,
ottenibile variando il raggio di interazione attrattiva tra i centri
dei dischi. Questa fase mostra una forte riduzione entropica con
eliche caratterizzate da un rapporto fra passo e raggio esattamente
uguale a quello delle alfa-eliche delle proteine[MMTB 2000] e con la
presenza di strutture a forcina e foglietti beta con la classica
struttura a zig-zag delle proteine. Nel limite della catena continua
le interazioni a coppia divergono perche' vi e' un numero continuo di
coppie vicine nella catena al di sotto del raggio di interazione[MFTBM
2005]. Una formulazione priva di singolarita' segue invece dalla
considerazione della presenza delle molecole di solvente. Le quantita'
termodinamicamente rilevanti per un tubo flessibile (o per un insieme
di tubi flessibili) in una soluzione formata da particelle colloidali
sferiche in presenza solamente di interazioni di volume escluso sono
determinate dalla geometria del tubo [KR 1997]. L'energia libera di
solvatazione puo' venir espressa in termini di volume accessibile, di
area di tubo accessibile alle particelle colloidali, di curvatura
media del tubo e di curvatura gaussiana della superficie del tubo
[GRMD 2007]. In stretta collaborazione con l'unita' di Venezia, ci
proponiamo di studiare sia analiticamente che numericamente gli
effetti di tutti questi quattro fattori sul diagramma di fase di un
singolo tubo immerso in un fluido colloidale. Prenderemo in
considerazione in particolare la dipendenza dalla densita' del
solvente e dalla tensione superficiale del tubo. Generalizzeremo
inoltre al caso di molti tubi che si aggregano.

2) Determinazione di potenziali efficaci per il ripiegamento di
proteine a partire dal principio di massima entropia

Le conoscenze fisiche attuali ci permettono di studiare in dettaglio
la dinamica di una proteina nel suo ambiente fisiologico. Tale
problema e` pero` estremamente complesso, a causa dell'enorme numero
di gradi di liberta` coinvolti, anche nel semplice caso costituito
dalle fluttuazioni conformazionali attorno allo stato nativo degli
enzimi, le quali ricoprono un ruolo importante per il riconoscimento
dei substrati e/o per la catalisi. La funzione biologica di una
proteina infatti dipende, in linea di principio, da tutti i suoi atomi
e dalle molecole d'acqua circostanti. Il principale limite della
dinamica molecolare, in quest'ambito e` rappresentato dalla scala di
tempo accessibile (attualmente non maggiore al
microsecondo). Riprodurre il processo di folding e` ancora piu`
proibitivo a parte segmenti proteici molto piccoli (dell'ordine della
decina di amminoacidi)[BGLP 2006]. Spesso inoltre non e` importante
conoscere in ogni dettaglio il processo, ma e` piuttosto interessante
concentrarsi su pochi gradi di liberta`. La ricerca delle interazioni
efficaci tra i gradi di liberta` "principali" e` pero` molto
complicata e non esistono regole generali per determinarle (la
determinazione potrebbe risultare piu` complessa dello studio
dell'intero sistema). Esistono alcuni metodi empirici in
letteratura[MJ 1985], alcuni dei quali proposti dal nostro gruppo, per
assegnare uno stato nativo ad una sequenza aminoacidica. Per la
determinazione dei potenziali efficaci, intendiamo ora utilizzare un
principio di carattere piu` fondamentale: il principio di massima
entropia (MaxEnt). Si tratta di un metodo variazionale [B 1964, S
1948, J 1957a,b] ampiamente usato per l'analisi sia di sistemi
complessi in equilibrio che fuori dall'equilibrio (tutti gli ensembles
meccanico statistici possono essere derivati molto elegantemente a
partire dal MaxEnt), e viene utilizzato sempre di piu` in molti
contesti come la ricostruzione di immagini IMAGE, la cristallografia
[DGVZPB 1995], le scienze della terra, [SB 1984], lo studio delle
proteine [WJDG 2006], la spettroscopia NMR [SSBLS 1984], la
diffarzione dei raggi X [KKK 2002], la fisica della materia condensata
[RRKB 2002], le scienze planetarie [TMHD 2001] ecc.... Il suo utilizio
richiede un passaggio chiave, la determinazione (tramite esperimenti)
dei vincoli fisici che devono essere imposti a partire dalle parziali
informazioni sul sistema: ad esempio la determinazioni sperimentale
del raggio di girazione della proteina, il numero medio di contatti
tra coppie di aminoacidi, etc.. in corrispondenza di particolari
condizioni di temperatura, ph, ecc.. La massimizzazione dell'entropia
sotto queste condizioni permette di determinare la probabilita` che
una proteina si trovi in uno stato contrassegnato dai gradi di
liberta` "principali" dati. Il logaritmo di questa quantita` e`
direttamente legato all'opposto dell'interazione "efficace" tra tali
gradi di liberta`. Abbiamo gia` testato il metodo su modelli esatti su
reticolo. In tutti i casi l'approccio riproduce il corretto stato
nativo associato ad una sequenza protein-like, anche quando uno ha a
disposizione una conoscenza incompleta dei vincoli [STBM, 2007].

3) Aggregazione e formazione di amiloidi

In molte patologie neurodegenerative, le proteine si aggregano in
particolari strutture fibrose formando delle placche insolubili note
come amiloidi[CD 2006]. Si tratta di strutture che possono ricoprire
in alcuni organismi anche un ruolo funzionale[CD 2006]. Un elemento
comune agli amiloidi e` una specifica architettura sovramolecolare
chiamata struttura cross-beta, composta da legami idrogeno che formano
uno schema regolare lungo l'asse della fibrilla. Assumendo che le
interazioni dipendenti dalla specificita` aminoacidica, capaci di
stabilizzare i legami idrigeno nelle proteine globulari, svolgano la
stessa funzione negli amiloidi, abbiamo recentemente introdotto
l'algoritmo PASTA[TCMS 2006], il quale predice quale porzione di una
data sequenza e` piu` propensa a formare amiloidi. Questo algoritmo e'
basato su un potenziale ricavato a partire dalla propensita` che due
diversi aminoacidi si trovino appaiati in due filamenti adiacenti di
un foglietto-beta nelle proteine globulari. Esso e` capace di
localizare con buona accuratezza le regioni di aggragazione di alcune
proteine nativamente non ripiegate. L'algoritmo PASTA e` attualmente
disponibile via web-server[TST 2007]. In questa linea di ricerca, ci
proponiamo due obbiettivi diversi e complementari: migliorare
l'algoritmo esistente (sviluppo dei metodi), e impiegarlo per predire
la struttura degli aggragati (architettura topoologica degli amiloidi)
per diverse sequenze.

a.Metodi

Desideriamo migliorare l'algoritmo su piu` fronti. Inanzi tutto e`
necessario tenere conto in modo piu` completo della perdita di
entropia conseguente all'aggregazione in strutture ordinate quali
quella cross-beta. Un termine ad essa associato e` gia presente in
PASTA; esso e` pero` indipendente dalla specificita` della sequenza,
fattore di cui vogliamo adesso tenere conto. In letteratura si trovano
dati sull'entropia persa a causa dell'ordinamento delle catene
laterali[GNS 2002]. Alternativamente gli stessi parametri si possono
ottenere anche con il metodo di massima entropia, fittando i risultati
sperimentali. PASTA attualmente puo` essere usato per prediere
semplici aggregazioni tipo beta (accoppiamento beta)
inter-molecolari. Ma anche l'accoppiamento beta intra-moleculare ha un
ruolo importante nell'aggragazione amiloide: induce sia strutture
cross-beta in proteine intrinsecamente non strutturate, sia scambio di
domini ed altri meccanismi di aggragazione in grado di produrre
fibrille che conservano parzialmente struttura e funzioni native[SLSGD
2005, BCCPTC 2005]. Ci proponiamo quindi di poter predire anche
l'accoppiamente beta intra-molecolare tenendo conto in modo
appropriato dei contributi entropici a seconda dei diversi segmenti di
sequenza che prendono parte a tali strutture. La competizione tra
accoppiamento beta inter- ed intra-molecolare verra` controllata dalla
concentrazione molecolare, permettendo cosi` un confronto diretto con
i dati sperimentali sulla dipendenza tra concentrazione ed
aggragazione. Come ulteriore miglioramento intendiamo inserire in
PASTA dei potenziali, dipendenti dalla sequenza, che tengano conto dei
bias conformazionali locali della catena proteica, e che verranno
determinati con metodi di massimizzazione di entropia, o con metodi
knowledge-based[FRSS 2004]. Vogliamo inoltre provare ad usare PASTA
per la predizione di foglietti-beta nelle proteine globulari e per lo
studio di interazioni proteina-proteina tramite "beta-addition".

b.Architettura degli amiloidi

Per studiare le fibrille amiloidi sono state impiegate tecniche
sperimentali sofisticate, quali NMR a stato solido, o cristallografia
a raggi X, micro o nano[S 2007]. La loro struttura non e` ancora del
tutto chiara, ed esistono in letteratura numerosi modelli in attesa di
una verifica sperimentale. Intendiamo impiegare PASTA, assieme ad un
nostro modello coarse-grained per la catena proteica [HTSBM 2004,
HMTSBM 2006], al fine di simulare l'aggragazione di amiloidi e predire
la loro struttura. Il potenziale di accoppiamento beta usato in PASTA
verra` implementato nell'ambito di un modello coarse-grained,
identificando, attraverso simulazioni Monte Carlo, le strutture
putative di minima energia. Alternativamente, gli accoppiamenti tra
sequenze predetti da PASTA verranno usati alla stregua di bias sul
funzionale energia coarse-grained, cosi` come avviene nei modelli di
tipo Go. L'obbiettivo a lungo termine e' ottenere un metodo capace,
per una data sequenza, di determinare la tipologia della struttura
aggregata, a partire dallo stato monomerico fino alla fibrille nel suo
stadio piu` maturo. Data la complessita` dell'obbiettivo, se il nostro
modello non fosse sufficientemente dettagliato per descrivere
correttamente tali configurazioni, intendiamo collaborare con L'UR di
Bari, per riuscire ad implementare dettagli all-atoms all'interno del
nostro modello. Inizialmente ci focalizzeremo sul misfolding e
l'aggregazione di proteine che sono studiate dai nostri partner
sperimentali nelle URs di Firenze e Roma. Nel caso del dominio PDZ e
dell'acilfosfatasi, i risultati sperimentali verranno usati per
guidare e confermare il nostro modello. Una volta avallato, il metodo
vera` utilizzato per studiare il meccanismo di aggregazione di alcune
proteine gia` estensivamente studiate, quali la alpha-sinucleina e
l'abeta-peptide che sono coinvolte nelle patologie neurodegenerative,
come il morbo di Parkinson e l'Alzheimer.

4) Dinamica dell'espressione di proteine nelle cellule

L'approccio sviluppato dal nostro gruppo negli studi sugli ecosistemi
puo` essere esteso alla predizione della distribuzione proteica nelle
cellule. La cellula puo` essere vista come un ecosistema e ogni tipo
di proteina come una specie diversa. Attraverso questa analogia e`
possibile studiare il processo stocastico che conduce alla
distribuzione delle diverse proteine nella cellula in regime
stazionario. L'obbiettivo e` quindi predire tale distribuzione a
seconda di quale sia lo stato specifico della cellula. Un punto
cruciale e` chiarire la natura del rumore stocastico il quale fa si
che la produzione proteica avvenga "a scatti", in numero variabile ed
a intervalli casuali[MA 1997]. Cio` e` in disaccordo con la dinamica
stocastica usata per modellizzare gli ecosistemi dove, per effetto del
teorema del limite centrale, si e` in presenza semplicemente di un
rumore bianco gauissiano. L'espressione dei geni nelle cellule, la
trascrizione del DNA in RNA messaggero e la conseguente traslazione in
proteine, avviene stocasticamente a causa dello scarso numero di copie
di DNA ed RNA coinvolte nel processo. L'importanza del rumore di
traduzione nelle reti genetiche e` stato evidenziato abbastanza di
recente [PE 2000]. Nei nostri studi sulla dinamica delle foreste
tropicali [APBM 2006] e` stato stimato che sistemi ecologici di quel
tipo possono avere tempi di ricorrenza dell'ordine delle poche
migliaia di anni. Al contrario le scale di tempo coinvolte nelle
cellule molto minori (dell'ordine del minuto, secondo gli esperimenti
di Xie e collaboratori [YXRLX, 2006]). Percio` le cellule
costituiscono un campo di prova ideale in quanto le predizioni possono
essere testate su scale di tempo piu` corte. In dettaglio ci
proponiamo di predire: (a) la concentrazione di proteine nella cellula
vivente in condizioni stazionarie; (b) la distribuzione di turnover
cellulare (l'analogo della distribuzione di turnover nelle specie,
comunemente usato negli studi di ecosistemi, ma mai misurato in questo
contesto); (c) le funzioni di correlazione dei tempi per la
concentrazione di proteine.