RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Amiloidi e ripiegamento di proteine: un approccio teorico-sperimentale

Università di riferimento

Università "Ca' Foscari" di VENEZIA - CHIMICA FISICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Achille Giacometti

Descrizione

Il nostro contributo al progetto seguirà due linee di azione, uno al livello di struttura secondaria e un altro a livello di struttura terziaria. La UR di Venezia sarà la principale responsabile dell’effetto del solvente nel processo di ripiegamento/dispiegamento e delle aggregazioni tra proteine. Il nostro approccio sarà principalmente teorico, e il nostro interlocutore principale sarà la UR di Padova.
Obiettivo a: Solvatazione di una proteina in soluzione mediante una connessione tra geometria e termodinamica.
Come già anticipato nella parte introduttiva, la UR di Padova in collaborazione con J. Banavar della Penn State University, ha introdotto il concetto di modello a “tubo” come la descrizione più semplice e corretta del volume escluso negli omopolimeri. La presenza di catene laterali portano a effetti sterici che sono ben descritti dai grafici di Ramachandran (Braden e Tooze 1999). Nel modello a tubo, tale effetto è incorporato nell’esistenza di uno spessore finito che evita l’utilizzo delle singolarità presenti nel modello di Edward e caratteristica della teoria dei polimeri (Doi e Edward 1986, de Gennes 1979, Rubistein e Colby 2003, des Cloizeaux e Jannik 1990). In una collaborazione recente con la UR di Padova (Giacometti et al 2007) abbiamo studiato un tubo inpenetrabile e flessibile (modello a tubo) in una soluzione formata da particelle colloidali sferiche, e abbiamo chiarito il ruolo dell’entropia del solvente nella formazione di strutture secondarie quali alfa eliche e foglietti beta. La nostra analisi è basata sul lavoro di Snir e Kamien (Snir e Kamien 2005, Snir e Kamien 2007) che hanno suggerito che la natura delle interazioni efficaci tra le diverse parti del tubo potessero essere spiegate da un meccanismo analogo a quello molto popolare, nella comunità di chi studia i sistemi colloidali, e noto come meccanismo di Asakura-Oosawa-Vrij (AO) (Asakura e Oosawa 1954 e 1958, Vrij 1976, Braden et al 2003, Dijkstra et al 1999). Esso può essere discritto in modo semplice ricordando che l’aggiunta di polimeri non assorbenti ad una soluzione colloidale provoca una attrazione efficace tra le particelle colloidali dovuta alla pressione non bilanciata che i polimeri esercitano sui colloidi in modo da tenerli il più vicino possibile. Un modo equivalente di guardare a tale fenomeno è quello di considerare i polimeri come delle sfere molto più piccole dei colloidi: esse verranno escluse dai colloidi per un volume di una sfera di raggio pari alla somma dei raggi della sfera colloidale (grande) e del polimero (sfera piccola). Quando tale volume ha una sovrapposizione non nulla, c’è un guadagno di tipo entropico per il solvente e il sistema è più stabile da un punto di vista termodinamico. Snir e Kamien suggerirono che se le diverse parti di un tubo di spessore finito vengono in contatto tra loro, il meccanismo AO permette una transizione da polimero esteso a elica. Il grosso vantaggio di questo scenario è che tale meccanismo AO permette di variare sia l’estensione che l’intensità della forza di attrazione tra le particelle colloidali cambiando rispettivamente il raggio della sfera piccola (polimeri) e la loro concentrazione. I dettagli di tale processo, sono stati però spiegati solo successivamente dalla collaborazione delle UR di Venezia e Padova.
Oltre al volume escluso, la presenza del solvente comporta un altro effetto importante sulla proteina detto “effetto idrofobico”. Si assuma che la proteina (catena polipeptidica più catene laterali) consista di una parte polare (idrofilia) e di una non polare (idrofobia). In tal caso, è ben noto che ogni molecola idrofobia fornisce, in presenza di acqua, un contributo positivo all’energia libera proporzionale all’area “esposta” della molecola al solvente (Finkelstein e Ptitsyn 2002). Le proteine tendono quindi a schermare questi aminoacidi non polari al loro interno per abbassare l’energia libera. Un recente studio della UR di Padova (Banavar et al 2007) ha verificato che questo meccanismo è sufficiente per formare alfa eliche e foglietti beta; in generale quindi, ci si aspetta che sia il volume escluso, sia l’energia esposta, siano entrambi cause concorrenti per la formazione dei motivi ricorrenti della struttura secondaria delle proteine. Molto di recente (Hansen-Goos et al 2007), il gruppo facente capo a S. Dietrich in Germania, ha suggerito una forma generale di energia di solvatazione, basata su una interessante connessione tra geometria e termodinamica (Koning et al 2004), che comprende sia il volume escluso, sia gli effetti idrofobici, come casi particolari. D’altra parte, la loro analisi si è limitata allo studio delle alfa eliche infinite. La nostra metodologia è invece basata su metodi analitici e simulazioni Monte Carlo ed è in grado di studiare altre strutture secondarie e soprattutto la loro formazione. Ci proponiamo di includere questa nuova idea all’interno del nostro approccio: in tal modo saremo in grado di disegnare l’intero diagramma di fase in funzione sia del raggio dell’interazione tra le varie parti del polimero, sia della sua intensità. Inoltre, saremo in grado di fornire una stima dei pesi relativi del volume escluso e dell’effetto idrofobico sulla formazione di strutture secondarie, mediante il disaccoppiamento dei due termini, in modo da comprenderne i rispettivi ruoli. Un ulteriore punto qualificante, sarebbe quello studiare anche la variazione di entropia del polimero e l’energia libera di curvatura. L’importanza di quest’ultima è stata accennata (ma non esplicitata) nel lavoro di Snir e Kamien (Snir e Kamien 2007), mentre la prima è stata studiata in un contesto differente da Kinoshita e collaboratori (Harano et al 2007, Kinoshita 2006, Harano et al 2006, Harano e Kinoshita 2006) in Giappone usando un metodo combinato di equazioni integrali e simulazioni numeriche. Il loro risultato è che il guadagno in entropia del solvente supera la perdita di entropia conformazionale del polimero per effetto del processo di ripiegamento, se il numero di residui è sufficientemente grande. Ci proponiamo di affrontare questo problema nel contesto del modello a tubo in collaborazione con la UR di Padova, mediante varie tecniche che variano dalla simulazioni numeriche a semplici modelli meccanico-statistici su reticolo e nel continuo.
Obiettivo b: Diagramma di fase per proteine globulari in soluzione.
Come discusso in precedenza, le proteine tendono a mettere le parti idrofobiche nel “cuore” della proteina nel processo di ripiegamento. D’altra parte, esistono tutta una serie di cause che cospirano contro questo risultato di tipo “micella ideale”; in tal modo il risultato finale, a livello di struttura terziaria, consiste di una serie di parti eterogenee aventi nella superfice esterna (esposta all’acqua) un insieme di “pezze” idrofobiche di dimensioni e forme differenti. Queste ultime sono in effetti una delle cause principali per l’aggregazione di proteine differenti per formare strutture più grandi. Motivati da queste ragioni il nostro gruppo, in collaborazione con colleghi dell’Università di Trieste e di Cambridge, ha considerato un fluido di sfere rigide sulle quali erano distribuite una o due delle superfici adesive circolari di dimensioni variabili con il vincolo che non si sovrapponessero tra loro (Fantoni et al 2007). In tale modello, due sfere del fluido si attraevano mediante un potenziale adesivo introdotto da Baxter (Baxter 1968) solamente se i prolungamenti delle direzioni dei versori di queste superfici si intersecavano tra loro in qualche punto; in caso contrario l’interazione era di tipo sfere rigide. Si tratta di una modifica di un modello introdotto da Kern e Frenkel ed analizzato mediante simulazioni di tipo Monte Carlo (Kern e Frenkel 2003). Usando una teoria approssimata per la soluzione delle equazioni integrali basata su una classe di espansioni in densità della funzione di correlazione diretta (indicate con C0, C1, C2, ..ecc) che era stata introdotta dal nostro gruppo qualche tempo fa (Gazzillo e Giacometti 2004), ci è stato possibile una descrizione completa della transizione fluido-fluido e della transizione percolativa che è stata confrontata con le simulazioni di tipo Monte Carlo fatte a tal scopo. Si tratta di un problema molto difficile: nondimeno per la semplicità delle due approssimazioni più semplici (C0 e C1) è stato possibile affrontare questo problema usando delle metodologie proposte in passato nel campo dei liquidi molecolari. A dispetto del carattere delle approssimazioni, valide a bassa densità, la teoria è in grado di predire l’andamento qualitativo corretto del diagramma di fase fluido-fluido fino anche ad un livello semiquantitativo. Val la pena sottolineare che l’introduzione dell’anisotropia nelle interazioni, costituisce il primo passo verso una descrizione più realistica del diagramma di fase per le proteine in soluzione. Un ulteriore vantaggio della nostra analisi è quella di poter variare sia il numero di superfici adesive , la “valenza”, si le loro dimensioni, a differenza di approcci precedenti dove solo la valenza poteva essere analizzata in dettaglio (Bianche et al 2006, Sciortino et al 2005). Val la pena notare che questi studi sono importanti anche dal punto di vista tecnologico, in quanto particelle “pezzate” forniscono la possibilità di progettare strumenti mediante decorazione anisotropa della superficie delle particelle per mezzo di molecole organiche o biologiche (Zhang e Glozer 2004, Cho et al 2005). La Natura fornisce un’ispirazione per quello che potremmo costruire in questo campo, ed un esempio particolarmente elegante è fornito dall’autoassemblamento di capsidi virus.
Essi sono strutture monodisperse e fortemente simmetriche composte da tante sottounità identiche. E’ in corso una descrizione semplificata di virus di forma a icosaedro con subunità sferiche ed interazioni direzionali (Hagan e Chandler 2006, Wilber et al 2007), ed è anche sotto analisi la possibilità di adottare schemi simili per l’autoassemblamento di altre strutture (Zhang e Glozer 2004). Questo livello di organizzazione necessariamente richiede una certa specificità nelle interazioni tra le varie sottounità e delle ulteriori precauzioni per evitare l’ulteriore aggregazione delle strutture risultati. Uno dei principali svantaggi dal punto di vista teorico, della distribuzione dell’adesione in “pezze”, è quello di non poter usare l’espansione in armoniche sferiche a causa della discontinuità del potenziale. In uno studio parallelo (Gazzillo et al 2007), la UR di Venezia ha analizzato un modello dove l’anisotropia nelle interazioni è distribuita con continuità a simmetria dipolare. Ciò permette l’utilizzo di una tecnica inventata da Wertheim (Wertheim 1971), di nuovo nel contesto del fludi molecolari, che permette una soluzione quasi completa in approssimazione di Percus-Yevick (PY). A differenza delle approssimazioni descritte precedentemente di natura perturbativa (C0, C1,…) la chiusura PY è basata su una opportuna somma di tali espansioni e quindi non soffre delle stesse limitazioni (Stell 1991, Hansen e McDonald 1986). Basandosi sul nostro lavoro precedente fatto in collaborazione con i colleghi di Trieste e Cambridge, ci proponiamo di estendere lo studio del modello a “pezze” usando approssimazioni più sofisticate per le equazioni integrali. Nonostante ci sia una procedura ben definita simile a quella del caso dei fluidi molecolari (Gray e Gubbins 1984), esistono una serie di fatti specifici caratteristici delle proteine che andranno inclusi nell’analisi. A differenza del caso dei fluidi molecolari, ad esempio, la dimensione delle “pezze” è un fattore determinante in quanto è possibile formare più legami anche con una sola pezza purchè di dimensioni sufficientemente grandi. Nel caso dei fluidi molecolari, invece, il vincolo di singolo legame per singola parte attrattiva, fa sì che le dimensioni della pezza siano irrilevanti e possano essere risommate in quantità puntiformi distribuite lungo la sfera. Ci proponiamo di affrontare questo problema piuttosto difficile in collaborazione con F. Lado dell’Università della North Caroline e con il gruppo di G. Pastore all’Università di Trieste: questo studio dovrebbe corroborare le predizioni fatte dal nostro gruppo negli studi precedenti. Siamo anche in contatto con il gruppo di F. Sciortino dell’Università di Roma La Sapienza, per sostenere le nostre teorie con simulazioni di tipo Monte Carlo. Ci aspettiamo inoltre di poter estendere anche lo studio del modello dipolare all’analisi dell’intero diagramma di fase per la transizione fluido-fluido. Questo dovrebbe comportare un paragone estremamente interessante con il caso del modello a “pezze”. Infine, ci proponiamo anche di collaborare con un gruppo Spagnolo sulla soluzione di sfere rigide permeabili con adesione. Tale nuovo modello è interessante in quanto la mancanza del vincolo di impermeabilità infinita, può fornire delle transizioni di fase anche a bassa dimensionalità senza violazione dei teoremi di impossibilità. E’ stato mostrato tanto tampo fa (Poland e Scheraga 1970) che questa cosa potrebbe avere delle conseguenze per la transizione struttura estesa-struttura elicoidale.
Collaborazione con le altre UR.
Non vi è dubbio che entrambi i nostri obiettivi guadagneranno significatività dalla consulenza dei fatti sperimentali da parte delle UR di Firenze e Roma. Il loro progetto è focalizzato sulla PDZ che è una delle interazioni proteina-proteina più comuni negli umani (Jemth e Gianno 2007). Il nostro approccio a “grana-grossa” descrive le interazioni non specifiche che sono presenti in tutte le proteine. Ci proponiamo di collaborare con le UR di Padova e Bari per confrontare i nostri approcci con quelli complementari presenti in letteratura (Shen et al 2006). Questa possibilità di predire la posizione della linea di coesistenza fluido-fluido per i diagramma di fase delle proteine, rispetto ad esempio alla temperatura di dispiegamento, costituirebbe un passo importante per la predizione e l’allontanamento di fenomeni di precipitazioni non volute. E’ interessante sottolineare che gli sforzi combinati delle UR di Venezia, Padova e Bari, potrebbero portare ad una proposta di un possibile meccanismo per la formazione di fibrille amiloidi che sono associate ad importanti malattie quali l’Alzheimer e le encefalopatie spongiformi. E’ stato verificato che la formazione di fibrille amiloidi avviene in diverse proteine a dispetto delle differenti strutture secondarie e terziarie, e quindi si è pensato che potesse essere causata da un effetto combinato delle proprietà della catena polipeptidica e del tipo di solvente (Kinoshita 2004). Il nostro approccio combinato dovrebbe essere in grado di fornire una prospettiva a tale possibilità.
Piano temporale del progetto.
1. Primo anno. Durante il primo anno di progetto, ci proponiamo di completare la prima parte dell’analisi per l’Obiettivo a, cioè l’estensione del diagramma di fase all’asse delle densità. Ciò richiede una serie di programmazioni di codici che prenderanno la maggior parte del tempo e costituiranno un miglioramento non banale del lavoro esistente. Per quanto riguarda l’Obiettivo a, ci aspettiamo di completare l’analisi del fluido con adesione dipolare e di implementare la collaborazione sulle sfere permeabili con adesione.
2. Secondo anno. Nel corso del secondo anno di progetto, abbiamo in mente di intraprendere lo studio completo del diagramma di fase con particolare enfasi sul peso relativo dei due effetti, in modo da proporre un confronto accurato con i risultati dei lavori dei gruppi tedesche e giapponesi. Inoltre, sempre nello stesso contesto e nel secondo anno, ci proponiamo lo studio dei modelli meccanico-statistici con lo scopo di capire bene l’effetto del solvente. D’altra parte, gran parte dello sforzo del nostro gruppo verrà dedicato alla scrittura di nuovi codici numerici per la soluzione del modello di Kern e Frenkel nell’ambito dell’Obiettivo b.