RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Amiloidi e ripiegamento di proteine: un approccio teorico-sperimentale

Università di riferimento

Università degli Studi di BARI - BIOCHIMICA MEDICA, BIOLOGIA MEDICA E FISICA MEDICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gianluca Lattanzi

Descrizione

Il nostro programma di ricerca è basato sulle simulazioni al calcolatore in dinamica molecolare classica e metadinamica. La nostra metodologia sarà di complemento alla strategia semplificata proposta dalle Unità di Ricerca di Padova e Venezia e si avvarrà di una continua interazione con le Unità di Ricerca sperimentali di Roma e Firenze. Il nostro obbiettivo è lo sviluppo di un protocollo di simulazioni per approfondire l’associazione con ligandi e l’interazione proteina-proteina nel contesto dell’aggregazione di fibrille amiloidi. Il progetto verterà su due sistemi: il dominio legante PDZ e proteine rappresentative della famiglia delle acilfosfatasi. Entrambi i sistemi sono piccole proteine, la cui struttura è stata determinata con buona risoluzione (Doyle et al. 1996, Gianni et al. 2006, Corazza et al. 2006), e condividono una tendenza a formare aggregati amiloidi (Plakoutsi et al. 2006).

a) Dominio PDZ2. La struttura del secondo dominio PDZ della tirosina fosfatasi bas-like (PDZ2) è stata risolta attraverso risonanza magnetica nucleare in presenza ed in assenza di un peptide legato (Gianni et al. 2006, Walma et al. 2002). In un primo passo verso la caratterizzazione del meccanismo di associazione, il modello molecolare della PDZ2 con o senza peptide legato sarà portato all’equilibrio in simulazioni di dinamica molecolare. Tale passo è necessario per poter affrontare la ricostruzione del profilo completo di energia libera della reazione di associazione mediante metadinamica. Saranno compiuti diversi calcoli di metadinamica per ottenere una buona accuratezza per il profilo di energia libera, seguendo la procedura riportata in lavori precedenti (Gervasio et al. 2005). Inoltre, la metadinamica sarà impiegata per lo studio delle conformazioni mal ripiegate della PDZ2, analogamente a quanto riportato in letteratura per il prione (Barducci et al. 2006). Riteniamo che tali studi possano aiutare a fornire un fondamento molecolare per i meccanismi esplorati in esperimenti condotti dalle Unità di Ricerca di Roma e Firenze. Mutazioni puntuali saranno analizzate attraverso la tecnica dell’integrazione termodinamica (Villa & Mark, 2002; Villa et al., 2003). L’effetto di tali mutazioni sulla stabilità della PDZ2 e sulla sua affinità verso il peptide sarà determinato seguendo il protocollo di metadinamica sviluppato per la proteina non mutata. In collaborazione con l’Unità di Ricerca di Padova, intendiamo esaminare le proprietà di aggregazione della PDZ2: questo aspetto è di fondamentale importanza per l’intero progetto, in quanto rappresenta il primo passo nel processo che porta alla formazione delle fibrille amiloidi. Affronteremo questo problema seguendo essenzialmente due strategie: la prima perfezionerà, mediante dinamica molecolare classica, un modello di dimero di PDZ2 ottenuto dai modelli semplificati sviluppati dall’Unità di Ricerca di Padova; la seconda strategia coinvolgerà il programma HADDOCK (Dominguez et al. 2003), un algoritmo per il docking molecolare che si avvale di dati biochimici e/o biofisici sulle interazioni per determinare la struttura dei complessi proteina-proteina. Entrambe le strategie forniranno modelli di un dimero di sottounità PDZ2 che sarà successivamente analizzato seguendo lo stesso protocollo di simulazione messo a punto per l’associazione tra il monomero della PDZ2 e il suo peptide substrato. In particolare, la metadinamica consentirà di ricostruire il profilo di energia libera per l’associazione tra due monomeri di PDZ2 e di individuare gli stati di transizione in tale processo. L’intera procedura può essere ripetuta per i mutanti della PDZ2.
Questa parte del progetto sarà condotta in stretta collaborazione con le Unità di Ricerca sperimentali di Roma e Firenze: procederà in parallelo agli studi computazionali delle Unità di Ricerca di Padova e Venezia. Inoltre, il presente programma di ricerca riceverà sostegno tecnico e computazionale dalla collaborazione con il gruppo di Fisica Statistica e Biologica presso la Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati (SISSA) di Trieste.

b) Acilfosfatasi. Parallelamente alle indagini sperimentali dell’Unità di Ricerca di Firenze, intendiamo compiere studi computazionali su proteine rappresentative della famiglia delle acilfosfatasi. In particolare, prevediamo di analizzare le acilfosfatasi mAcP, ctAcP e Sso AcP, le cui strutture sono state risolte mediante cristallografia a raggi X e risonanza magnetica nucleare (Pastore et al. 1992, Thunnissen et al. 1997, Taddei et al. 1999, Chiti et al. 2001, Plakoutsi et al. 2004). Ci attendiamo di poter estendere gli studi a carattere sperimentale dell’Unità di Ricerca di Firenze, definendo le proprietà strutturali di queste proteine e dei loro mutanti con le stesse tecniche già descritte per il caso della PDZ2. La stabilità conformazionale dell’acilfosfatasi sarà determinata mediante metadinamica seguendo lo stesso procedimento definito per la PDZ2. Le strutture disponibili per l’acilfosfatasi non includono peptidi substrato, ma recenti esperimenti hanno provato l’esistenza di un’interazione di questa proteina con diverse molecole, quali fosfato inorganico (Soldi et al. 2006), lipidi, acidi nucleici e glicosamminoglicani, come l’eparina solfato (Calamai et al. 2006). In collaborazione con l’Unità di Ricerca di Firenze, intendiamo illustrare il meccanismo di associazione di alcuni di questi ligandi, in particolare dell’eparina solfato. Tecniche di modellistica molecolare saranno impiegate per ottenere una descrizione a livello atomistico dell’eparina solfato e/o di altri ligandi identificati dall’Unità di Ricerca di Firenze. L’interazione di tali molecole con l’acilfosfatasi sarà studiata seguendo la procedura già descritta per la PDZ2. In questo caso, saranno necessari studi preliminari di docking e dati sperimentali per determinare la geometria appropriata. La metadinamica consentirà successivamente di ottimizzare il complesso ottenuto e fornirà una stima quantitativa per l’energia libera di legame. Come per la PDZ2, la formazione di oligomeri sarà analizzata mediante un approccio multiscala che include i modelli semplificati proposti dall’Unità di Ricerca di Padova, algoritmi di docking e metadinamica. In particolare, prevediamo di chiarire l’effetto di ligandi fisiologici sul processo di aggregazione.
Questa parte del progetto sarà gestita in stretta collaborazione con le Unità di Ricerca di Firenze e Padova e si avvarrà della collaborazione con il Settore di Fisica Statistica e Biologica presso la Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati (SISSA) di Trieste.

I dimeri di PDZ2 e di acilfosfatasi costituiscono un banco di prova ideale per controllare la validità delle simulazioni MM/CG. In questi casi, la regione responsabile dell’aggregazione sarà rappresentata a livello di dettaglio atomistico, mentre il resto della proteina sarà descritto ad un livello semplificato. Il confronto con i calcoli atomistici dettagliati determinerà il grado di accuratezza delle diverse strategie MM/CG sin qui proposte e di quelle che prevediamo di aggiungere. Inoltre, tali calcoli consentiranno di estendere lo studio a strutture amiloidi notevolmente più complesse.

I risultati dei nostri calcoli su entrambi i sistemi saranno confrontati con dati sperimentali e forniranno un fondamento molecolare per l’interpretazione degli eventi associati con il riconoscimento di ligandi e l’aggregazione di proteine.

Il presente progetto si avvarrà delle risorse computazionali già disponibili presso la nostra Unità di Ricerca (4 CPU disponibili al momento + 8 CPU pianificate per operatività entro la fine del 2007). Le spese previste copriranno il costo di una workstation aggiuntiva con 8 CPU per un totale di 20 CPU dedicate al presente progetto. Risorse computazionali aggiuntive saranno fornite dalla collaborazione con la Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati (SISSA) di Trieste.
Il Dott. Giovanni Settanni del Medical Research Council di Cambridge (Regno Unito) ha deciso di unirsi alla nostra Unità di Ricerca per il presente progetto senza alcun compenso per la sua collaborazione, eccetto eventuali rimborsi per spese di viaggio e permanenza in sedi diverse da quella di servizio per le finalità del presente progetto. La sua esperienza sul ripiegamento di proteine (Settanni et al. 2002, Settanni et al. 2004, Rao et al. 2005), sulle simulazioni in dinamica molecolare classica (Settanni et al. 2003, Interlandi et al. 2006, Seeber et al. 2007) e sui modelli a solvente implicito (Settanni et al. 2005) porterà, con ogni probabilità, ad un aumento significativo della produttività di questa Unità di Ricerca per il raggiungimento degli obbiettivi di ricerca previsti.