RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Amiloidi e ripiegamento di proteine: un approccio teorico-sperimentale

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - SCIENZE BIOCHIMICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Carlo Travaglini Allocatelli

Descrizione

L’obiettivo del presente progetto di ricerca è duplice: i) chiarire e definire le relazioni tra residui aminoacidici importanti nei processi di folding delle proteine e residui che giocano ruoli cruciali nello svolgimento delle funzioni di riconoscimento molecolare, ii) investigare il ruolo svolto dalle proprietà topologiche della struttura 3D delle proteine quali la connettività di elementi di struttura secondaria e la localizzazione delle estremità N- e C-terminali nei processi di folding e riconoscimento di ligandi. In particolare ci proponiamo di comprendere come la dinamica interna delle proteine possa controllare un processo monomolecolare governato da meccanismi di riconoscimento intramolecolare come il folding, ma anche processi bimolecolari di riconoscimento di specifici ligandi. Il sistema modello che sarà utilizzato nel progetto è rappresentato da diversi domini PDZ, molti dei quali già disponibili presso il laboratorio della U.O. di Roma: il dominio PDZ2 ed una sua variante circolarmente permutata ottenuta tramite ingegneria proteica (CP1-PDZ2), il dominio PDZ isolato da una proteasi dell’alga verde Scenedesmus obliquus (D1pPDZ; che a sua volta rappresenta una variante naturalmente permutata dei domini PDZ canonici) ed una sua variante circolarmente permutata ottenuta tramite ingegneria proteica (CPa-D1pPDZ). Strumenti e metodologie informatiche saranno estensivamente utilizzate allo scopo di individuare altre varianti circolarmente permutate attraverso l’analisi dei genomi sequenziati.
Il meccanismo di folding dei domini PDZ. Questa linea di ricerca si occuperà di ottenere una descrizione quanto più possibile quantitativa e dettagliata del meccanismo di folding delle forme canoniche e permutate dei diversi domini PDZ. I risultati sperimentali saranno utilizzati i) per testare simulazioni del processo di folding tramite dinamica molecolare e procedure Monte Carlo in collaborazione con la U.R. di Padova, ii) per verificare l’esistenza di relazioni tra meccanismi di folding e proprietà strutturali nei domini PDZ. Le risposte a queste domande permetteranno di fare luce sul ruolo proposto per gli intermedi di folding con caratteristiche non-native nell’indurre processi di aggregazione e fibrillogenesi. Alcuni risultati preliminari ottenuti da una prima caratterizzazione della cinetica di folding del dominio D1pPDZ sembrano indicare che, contrariamente a quanto osservato per altri domini PDZ con topologia canonica, in questo caso si popoli un intermedio transiente che rappresenta una trappola cinetica in grado di competere con il percorso di folding produttivo. E’ ragionevole ipotizzare che questo stato intermedio sia caratterizzato da interazioni non-native. Insieme con dati sperimentali di folding (quali ad esempio i valori phi, vd. sotto), verranno applicate metodologie di modellizzazione molecolare nel tentativo di ricostruire la struttura di tale intermedio. E’ importante sottolineare che la descrizione della struttura di una trappola cinetica aggiungerebbe importanti prove sperimentali a favore della teoria dello “scenario energetico” formulata su basi teoriche per spiegare i meccanismi di folding delle proteine (energy landscape theory; 22). In questo contesto, le proteine circolarmente permutate rappresenterebbero “sequenze topologicamente frustrate” caratterizzate da un profilo energetico in cui le interazioni di tipo non-nativo svolgono un ruolo non trascurabile nella stabilizzazione di intermedi non produttivi (23).
In ultimo, in collaborazione con la U.R. di Firenze ci proponiamo di studiare le strette relazioni esistenti tra processi di folding produttivi e non produttivi (misfolding), valutando altresì la possibilità di intervenire su questi ultimi per correggerli.
Al fine di comprendere quale sia l’importanza della topologia nel controllare il processo di folding nei domini PDZ saranno utilizzate le seguenti due starategie: i) verrà analizzato il meccanismo di folding di CP1-PDZ2, una variante ingegnerizzata di PDZ2, circolarmente permutata, in cui i 2 filamenti beta coinvolti nel nucleo di folding precoce della proteina wild-type (8) sono uniti covalentemente da un nuovo legame peptidico e la catena polipeptidica è tagliata in un’altra posizione per generare due nuove estremità; e ii) verrà studiato il meccanismo di folding di D1pPDZ dall’alga verde Scenedesmus obliquus, un dominio PDZ circolarmente permutato evolutosi naturalmente. L’allineamento di sequenza su basi strutturali ha dimostrato che D1pPDZ presenta circa il 50% di omologia di sequenza con PDZ2. Questi due approcci sperimentali saranno portati avanti in stretta sinergia con metodiche di modellizzazione molecolare e di analisi di allineamenti di sequenza.
Primo anno. Una variante circolarmente permutata di PDZ2 è stata recentemente costruita nel nostro laboratorio tramite ingegneria proteica (CP1-PDZ2) ed è disponibile per studi di cinetica di folding. Al fine di ottenere una descrizione a livello quasi-atomico della struttura degli intermedi e degli stati di transizione di folding, noi intendiamo disegnare e purificare una estesa libreria di mutanti sito-specifici di CP1-PDZ2 e di condurre una dettagliata analisi dei valori phi. Sebbene lo stato nativo di CP1-PDZ2 appaia destabilizzato, esperimenti preliminari di legame al ligando suggeriscono che la sua struttura tridimensionale sia sostanzialmente mantenuta, in quanto le proprietà di legame risultano in larga parte inalterate. Metodiche di modellizzazione molecolare saranno indispensabili per chiarire questo punto. Sulla base dei risultati della caratterizzazione della cinetica di foling e della analisi dei valori phi, sarà possibile identificare possibili intermedi, assegnarne il ruolo cinetico nel percorso di folding e caratterizzarne la struttura.
Risultati preliminari sulla cinetica di folding del permutante circolare naturale D1pPDZ indicano la presenza di uno stato intermedio, che tuttavia sembra rappresentare una trappola cinetica, stabilizzata da interazioni non-native. Tali stati “mis-folded” sono stati raramente descritt inel caso di piccole proteine a singolo dominio, mentre possono essere più facilmente osservati nel caso d proteine caratterizzate da una topologia complessa (4, 24). La nostra ipotesi è che la stabilizzazione dell’intermedio “mis-folded” di D1pPDZ sia determinata dall’instaurarsi di interazioni tra i 2 ultimi filamenti beta; come è stato sottolineato precedentemente, nei domini PDZ canonici da metazoi questi due filamenti beta sono coinvolti nella formazione del nucleo di folding. E’ quindi evidente come questi risultati possano in ultima analisi gettare luce sui meccanismi adottati dalla catena polipeptidica per correggere errori nel processo di folding.
Costruzione di una variante circolarmente permutata di D1pPDZ (CPa-D1pPDZ).
La identificazione di forme circolarmente permutate non ancora annotate utilizzando strategie di ricerca standard non è facile perché questi algoritmi si basano su modelli statistici che non prendono in considerazione la possibilità della permutazione. Sarà quindi necessario sviluppare modelli statistici appropriati, ad esempio sulla base dei modelli Hidden Markov.
Secondo anno. Progettazione e purificazione di una estesa libreria di mutanti sito-specifici del dominio D1pPDZ al fine di condurre una dettagliata analisi del valore phi. I risultati permetteranno di chiarire i dettagli molecolari dello stato stato di transizione produttivo, nonché di identificare le interazioni che stabilizzano l’intermedio off-pathway. Il raggiungimento di questo obiettivo potrebbe dimostrarsi particolarmente interessante nel caso si riesca a dimostrare che l’intermedio off-pathway rappresenta una specie topologicamente frustrata (25). E’ infatti ragionevole supporre che nell’intermedio mis-folded del dominio PDZ permutato D1pPDZ si formino gli stessi contatti tra i due ultimi filamenti beta che nei domini PDZ canonici costituiscono il sito di nucleazione di folding. Esperimenti preliminari di cinetica di folding condotti su D1pPDZ indicano che alcune mutazioni sono in grado di favorire la formazione dell’intermedio off-pathway fino al punto di abolire completamente il percorso di folding produttivo che porta allo stato nativo. Questi risultati aprono la eventualità di poter studiare le proprietà strutturali dell’intermedio mis-folded in condizioni di equilibrio, sia spettroscopicamente che tramite metodiche di diffrazione dei raggi X. E’ da sottolineare come le procedure di cristallizzazione potrebbero essere enormemente facilitate grazie all’utilizzo di un robot di cristallizzazione ora disponibile presso il nostro laboratorio.
Sulla base dei risultati della ricerca in banche dati (vedi attività I anno), ci proponiamo di clonare ed esprimere nuove varianti circolarmente permutate di domini PDZ.
Caratterizzazione del meccanismo di folding di CPa-D1pPDZ.

I processi di riconoscimento e legame dei ligandi dei domini PDZ. L’interazione tra domini PDZ canonici e ligandi prevede che il ligando peptidico formi un foglietto beta insieme ad un filamento beta che appartiene al dominio PDZ mentre il lato opposto del ligando contrae delle interazioni con una alfa elica del dominio PDZ (26). Il gruppo carbossilico del residuo C-terminale del ligando è spesso solvatato dai gruppi amidici della catena principale, mentre le sue catene laterali idrofobiche vengono accommodate in una tasca del dominio PDZ (tasca di legame). La specificità di riconoscimento dipende dalla sequenza aminoacidica C-terminale (27-28). Sono tuttavia possibili altre modalità di legame, attraverso le quali i dominio PDZ riconoscono e legano motive interni delle proteine bersaglio (29). Le interazioni di riconoscimento PDZ-ligando sono state sino ad ora classificate in tre gruppi sulla base della natura chimica delle catene laterali presenti nel sito attivo (27). Tuttavia, alcuni recenti studi compiuti sul proteoma completo di topo hanno messo in discussione questa classificazione ed hanno mostrato che la specificità dei domini PDZ è distribuita uniformemente piuttosto che essere rigidamente determinata dai residui della tasca di legame (21). In linea con questa interpretazione, alcuni studi sperimentali e computazionali avevano suggerito che residui lontani dal sito attivo dei domini PDZ potessero influenzare l’affinità per i ligandi (30-33).
Primo anno. In questa fase del progetto ci proponiamo di investigare il meccanismo molecolare del processo di riconoscimento PDZ-ligando, utilizzando estensivamente la mutagenesi sito-specifica e la caratterizzazione della cinetica di legame. In particolare, focalizzeremo la nostra attenzione su i) il ruolo dei residui distanti dalla tasca di legame nel controllare la reazione, e su ii) la struttura dello stato di transizione per questo processo. I dati di cristallografia e NMR suggeriscono che piccoli peptidi di sequenza aminoacidica appropriata possono rappresentare una valida alternativa all’uso di target fisiologici proteici per studiare le interazioni PDZ-ligando. Abbiamo così recentemente esaminato la cinetica di legame di PDZ2 utilizzando piccoli peptidi marcati con una sonda fluorescente e corrispondenti al C-terminale della proteina bersaglio, sfruttando una metodica di fluorescenza basata sul trasferimento di energia accettare-donatore (FRET) ed un apparato di mescolamento ultra-rapido (19).
La rete di interazioni deboli che sono cruciali nello stabilizzare il complesso PDZ2-ligando può essere studiata con metodiche di ingegneria proteica. Un punto cruciale consiste nell’investigare in dettaglio le differenze tra domini PDZ con topologia canonica e varianti circolarmente permutate, al fine di comprendere il ruolo della connettività di sequenza nella definizione della rete di riconoscimento intermolecolare. Ci proponiamo inoltre di chiarire se le proprietà allosteriche di PDZ2 nella sua reazione di legame (19), sia influenzata dalla permutazione circolare; a questo scopo verranno progettati ed espressi un gran numero di mutanti sito-specifici della variante circolarmente permutata CP1-PDZ2 le cui proprietà di legame saranno dettagliatamente analizzate.
Analisi degli allineamenti di sequenza ottenuti su basi strutturali saranno condotte per identificare i residui conservati e coinvolti nella rete di riconoscimento in domini PDZ canonici e topologicamente alterati.
Secondo anno. Poiché la cinetica di legame dei domini PDZ naturalmente permutati non è ancora stata esplorata, ci proponiamo di studiare il processo di riconoscimento del ligando nel caso di D1pPDZ, utilizzando la stessa strategia descritta per la caratterizzazione della cinetica di legame di PDZ2. In questa fase del progetto, quindi, verranno caratterizzati diversi mutanti sito-specifici di D1pPDZ. Inoltre, poiché il riconoscimento ed il legame di target proteici possono essere processi estremamente rapidi, verranno utilizzate anche metodiche di cinetica ultra-rapida. La opportunità di utilizzare metodiche di mescolamento a flusso-interrotto con tecniche di mescolamento ultra-rapido ci permetterà di esplorare i primissimi eventi nel riconoscimento del peptide bersaglio e i cambiamenti conformazionali accoppiati alla formazione del complesso PDZ-ligando.
Caratterizzazione del meccanismo di riconoscimento dei ligandi di CPa- D1pPDZ.
Sarà inoltre valutata la possibilità di condurre esperimenti di cinetica di legame anche utilizzando ligandi proteici non troncati.
Il laboratorio della U.R. di Roma è adeguatamente attrezzato per condurre la ricerca proposta; è infatti disponibile tutta la strumentazione necessaria per il clonaggio, la mutagenesi, le crescite batteriche (anche su larga scala) e la espressione e purificazione di proteine ricombinanti. E’ inoltre disponibile un’ampia varietà di strumenti per la caratterizzazione delle proprietà spettroscopiche e termodinamiche delle proteine. La analisi della cinetica di folding è resa possibile dalla disponibilità di diversi apparati di mescolamento rapido (stopped-flow; risoluzione temporale nei millisecondi) e super-rapido (continuous-flow; risoluzione temporale nei microsecondi; 34).
E’ disponibile un robot per la cristallizzazione delle proteine ed un apparato di diffrazione della luce.
Analisi bioinformatiche. L'analisi delle sequenze per ricercare la presenza di eventuali domini circolarmente permutati e non ancora annotati si basera' sulla identificazione di regioni conservate che saranno utilizzate per costruire profili e modelli statistici tipo Hidden Markov Model. La costruzione dei modelli sulla base dei vincoli sperimentali si avvarra' del programma Rosetta sviluppato da David Baker (35), a tutt'oggi il piu' accurato per la costruzione di modelli tridimensionali (36). I modelli prodotti da Rosetta devono essere analizzati per identificare i piu' plausibili. Utilizzeremo il metodo Pcons (37), recentemente dimostratosi il migliore (38) e metodi attualmente in via di sviluppo nel nostro gruppo.