RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Amiloidi e ripiegamento di proteine: un approccio teorico-sperimentale

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - CENTRO INTERUNIVERSITARIO DI RICERCA SULLE BASI MOLECOLARI DELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Niccolo' Taddei

Descrizione

In una prima parte del progetto, questa UR affronterà lo studio del meccanismo di aggregazione del secondo motivo PDZ della fosfotirosina fosfatasi bas-like (PDZ2). Il processo di folding di questa piccola proteina è stato studiato in dettaglio nella UR coordinata dal prof. Carlo Travaglino-Allocatelli presso l'Università di Roma "La Sapienza" (Gianni et al., 2007). In particolare, concentreremo la nostra attenzione sulla tendenza ad aggregare degli intermedi parzialmente strutturati che si generano nel processo di folding. Studi recenti indicano che folding e aggregazione di una proteina possono essere considerati all'interno di uno scenario energetico comune in cui gli intermedi di folding rappresentano, almeno in parte, il punto di partenza di un processo di ripiegamento scorretto che alla fine conduce all'aggregazione proteica (vendruscolo & Dobsono, 2005; Wolynes, 2005). Per questo motivo, uno studio di questo genere deve essere svolto su un modello semplice come una piccola proteina monomerica, la cui struttura e meccanismo di folding sono noti in dettaglio. PDZ2 rappresenta perciò un modello perfetto (Gianni et al., 2005 & 2007; Chi et al., 2007).
Studi preliminari svolti in questa UR hanno consentito di individuare le condizioni sperimentali in cui PDZ2 va incontro ad aggregazione (dati non pubblicati). Questa parte del progetto dovrà essere svolta in stretta collaborazione con la UR dell'Università di Roma che, da parte sua, continuerà a studiare il processo di folding della stessa proteina. Lo scopo di questa parte del progetto è di tratteggiare lo scenario energetico in cui si collocano tutte le possibili conformazioni assunte da questo dominio proteico, dallo stato denaturato a quello nativo, passando attraverso tutti i possibili intermedi di folding, ma anche dallo stato aggregato monomerico e quello fibrillare, attraverso tutti gli intermedi oligomerici.
In una seconda parte del progetto, questa UR studierà il ruolo svolto da alcune molecole nel processo di aggregazione proteica. Numerose specie, fra cui glicosamminoglicani, proteina amiloide serica, lipidi, collageno e ioni metallici, sono stati trovate associate alle fibrille amiloidi nei depositi che si accumulano negli organi e nei tessuti nel corso di diverse malattie come il morbo di Alzheimer, il diabete di tipo-II e molte altre amiloidosi neurodegenerative e sistemiche (Tennent et al., 1995; Desai et al., 2005; Naiki et al., 2005; Gruys et al., 2006). Studi precedenti ci hanno consentito di definire i fattori chiave implicati nel processo di aggregazione in assenza di questi composti. Ciò ha portato allo sviluppo di alcuni algoritmi in grado di determinare, per esempio, le regioni che promuovono il processo di aggregazione di una sequenza polipeptidico destrutturata (Pawar et al, 2005; Trovato et al., 2006). Nei prossimi anni abbiamo l'intenzione di studiare le basi dell'aggregazione proteica in presenza di composti di rilevanza fisiologica, con lo scopo di determinare regole generali che abbiano una maggiore aderenza alle condizioni in vivo. I nostri studi si svolgeranno utilizzando come modelli sperimentali proteine della famiglia strutturale delle acilfosfatasi (AcP), la cui struttura tridimensionale, meccanismo di folding e processo di aggregazione sono noti in dettaglio. nel nostro laboratorio sono a disposizione sette acilfosfatasi di organismi diversi, come Homo sapiens (mAcP e ctAcP), Drosophila melanogaster (AcPDro1 e AcPDro2), E. coli (HypF-N e EcoAcP) e Sulfolobus sulfataricus (SsoAcP) (van Nuland et al., 1998; Pieri et al., 1998; Taddei et al., 1999; Chiti et al., 2001; Degl'Innocenti et al., 2003; Plakoutsi et al., 2004; Ramazzoti et al., 2006). Affronteremo lo studio dell'aggregazione in condizioni in cui la proteina è inizialmente allo stato nativo o denaturato. I dati ottenuti saranno confrontati con quelli prodotti su altri sistemi allo scopo di raccogliere un numero di informazioni sufficiente per poter generare modelli di validità generale. A tale proposito, sarà parte determinante del progetto l'interazione con le UR di Padova e Bari, in virtù della loro capacità di sviluppare modelli che possano essere validati sulla base dei nostri dati sperimentali.
Una delle caratteristiche di questa UR è data dalla capacità di produrre varianti mutazionali praticamente illimitate di una proteina specifica. Usando kit la cui funzionalità è ampiamente provata, uno o più residui amminoacidici possono essere sostituiti con amminoacidi desiderati. Questa unità di ricerca ha un’esperienza di lungo corso nel campo dell’ingegneria proteica e ha prodotto e pubblicato dati riguardanti più di 100 varianti di mAcP e HypF-N (Chiti et al., 1999; Chiti et al., 2002a; Chiti et al., 2002b; Calloni et al., 2005). I metodi di ingegneria proteica sono essenziali per determinare quali parti della sequenza e quali amminoacidi sono coinvolti nelle interazioni con le molecole associate ai depositi amiloidi in vivo.
Gli strumenti e l’equipaggiamento richiesto per il compimento del progetto proposto sono disponibili, se non indicato in modo diverso, in questa UR o nell’ambito dell’Università di Firenze. Per mutare i geni delle proteine desiderate saranno utilizzati kit per il rapido inserimento di una mutazione basati sull’impiego della reazione a catena della polimerasi (PCR). I geni mutati e wild-type saranno espressi e il risultante prodotto genico sarà purificato usando dei protocolli il cui funzionamento è comprovato (Taddei et al., 1996, 2001; Chiti et al., 2002a, 2002b). La tecnica del rivelamento del light scattering dinamico (DLS), così come gli esperimenti di cromatografia ad esclusione in HPLC, saranno utilizzati per individuare la presenza e determinare la dimensione di aggregati appena questi si formano. Esperimenti di cross-linking foto-indotto di proteine non modificate (PICUP) saranno effettuati e questi, insieme ai gel elettroforetici su sodio-dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE), serviranno per identificare aggregati della proteina di tipo oligomerico o di maggiori dimensioni rivelandone la dimensione approssimativa. Misure di dicroismo circolare (CD) nel lontano UV e di spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FT-IR) saranno utilizzate per determinare la presenza di struttura a foglietto beta o di altro tipo negli aggregati. Saggi colorimetrici, basati sulla capacità delle fibrille amiloidi e dei loro precursori di legarsi al Rosso congo (CR) e alla tioflavina T (ThT), saranno utilizzati per monitorare la formazione di aggregati a partire dalle varianti mutazionali delle proteine (Chiti et al., 2002a, 2002b). Uno spettrofotometro ed uno spettrofluorimetro saranno usati per effettuare questi saggi in presenza rispettivamente di CR e di ThT. I cambiamenti conformazionali rapidi che avvengono nell’ambito di qualche millisecondo, come le reazioni di folding e di unfolding coinvolte nei primi passaggi del processo di aggregazione, saranno monitorati mediante l’uso di due strumenti a flusso interrotto (stopped-flow), accoppiati a sistemi di rivelazione in fluorescenza e in dicroismo circolare. L’analisi della morfologia degli aggregati sarà effettuata per mezzo di microscopia a trasmissione elettronica. Una collaborazione con la Prof. Gliozzi dell’Università di Genova, renderà possibile l’utilizzo anche della microscopia a forza atomica per l’analisi morfologica e per la determinazione della dimensione degli aggregati proteici.