RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi

Università di riferimento

Università degli Studi di PARMA - CHIMICA ORGANICA E INDUSTRIALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Rosangela Marchelli

Descrizione

L’unità di Parma si è posta l’obiettivo di progettare e sintetizzare nuovi acidi peptido nucleici (PNA) specificamente destinati al riconoscimento dell’RNA, per essere utilizzati in diagnostica e come nuovi strumenti terapeutici. L’individuazione dei requisiti sterici a di binding dell’RNA è l’obiettivo preliminare che sarà perseguito nel progetto. Una volta individuate le caratteristiche strutturali ottimali del PNA, saranno realizzate le sintesi dei monomeri e degli oligomeri con particolare attenzione all’inserimento di centri stereogenici, preservando la purezza ottica. Nuovi metodi di sintesi saranno adottati anche per inserire nucleobasi modificate, che garantiscano una maggiore stabilità al duplex RNA:PNA e che possano essere modulati a seconda che si vogliano coniugare fluorofori labili in ambiente acido o basico.
Gli RNA target biologici saranno scelti in collaborazione con l’UO di Ferrara.
Anche la diagnostica biomedica e alimentare è uno degli obiettivi primari del nostro gruppo. Particolare attenzione sarà data alla costruzione di dispositivi (microarrays, light up probes, beacons, sistemi microfluidici) che utilizzino sonde a PNA.



Il programma di lavoro è il seguente:

Task 1. Progettazione di PNA per il targeting di RNA

1.1 Progettazione molecolare
Modelli strutturali dei duplex PNA-RNA elaborati attraverso tecniche di modellistica molecolare verranno ottenuti in collaborazione con l’unità di Napoli. In particolare, saranno valutate le proprietà conformazionali/configurazionali che permettono al PNA di meglio adattarsi nei duplex PNA-RNA, al fine di progettare nuovi monomeri ed oligomeri. Verrà valutato anche l’effetto dell’introduzione di centri stereogenici sullo scheletro dei PNA e di nucleobasi modificate sulla stabilità dei duplex.

1.2 Selezione delle sequenze
Verranno scelti target specifici che consentano di valutare le performance dei PNA e dei PNA modificati in modelli cellulari disponibili presso l’UO di Ferrara, con importanti applicazioni in biomedicina.
In particolare saranno considerati i seguenti target:
i) miRNA: l’identificazione di microRNA verrà eseguita utilizzando la banca dati miRBase, con particolare attenzione a micro-RNA che alterino l’espressione genica in cellule eritroidi ed a quelli coinvolti nella patogenesi tumorale.
ii) mRNA: verranno scelti come bersaglio mRNA utilizzabili in sistemi sperimentali già sviluppati presso l’unità di Ferrara, in particolare contro i seguenti target: mRNA antiapoptotici, in modo da indurre apoptosi di osteoclasti umani, con importanti applicazioni nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per l’osteoporosi, l’artrite reumatoide, le metastasi ossee, ecc.; mRNA per i quali esistono splicing alternativi per dirigere il percorso di maturazione dell’RNA, in particolare nel locus A-beta-H-J-J umano, che codifica per tre differenti proteine; mRNA che alterino l’espressione dei geni che codificano per i recettori degli estrogeni, in particolare Runx-2, ottenendo eventualmente una riduzione della capacità di metastatizzare.
iii) Sequenze di RNA da virus alimentari
Saranno scelti come target i virus alimentari (p.es. norovirus), che sono riconosciuti come importanti agenti eziologici nelle epidemie di gastroenteriti acute. Per valutare la presenza di microorganismi vitali in alimenti processati, e per distinguerli da quelli non vitali si sceglieranno sequenze di RNA, piuttosto che di DNA da riconoscere, al fine di distingere organismi vitali da quelli morti.



Task 2. Sintesi di PNA modificati

2.1 PNA con scheletro modificato
Il gruppo di Parma ha sintetizzato in precedenza nuovi PNA a scheletro modificato di sterochimica definita, ottenuti inserendo centri stereogenici D- o L- nelle posizioni C2 (alfa) o al C5 (gamma) del monomero o in entrambe. Gli studi di complessazione verso sequenze di DNA complementari hanno dimostrato come la miglior configurazione stereochimica, in termini di affinità e specificità nel legame con il DNA, fosse l’unità monomerica contenente allo stesso tempo residui 2D e 5L derivati da lisina.
In questo progetto l’unità di Parma studierà innanzitutto i requisiti sterochimici per legare l’RNA. Saranno sintetizzati PNA aventi diversi stereocentri nello scheletro, ai fini di valutare se vi siano requisiti sterici preferenziali per la complessazione dell’RNA, in confronto con il DNA. Diversi gruppi carichi positivamente, derivati da arginina, lisina, ornitina, verranno inseriti sia alle posizioni C2 (alfa) sia al C5 (gamma) del monomero, ai fini di aumentare l’affinità di legame con l’RNA.
In base a metodiche sviluppate presso il gruppo di Parma, monomeri di PNA chirali sono generalmente inseriti nelle sequenze di PNA attraverso la cosiddetta strategia submonomerica, nella quale il legame della carbossimetilnucleobase allo scheletro del PNA ha luogo solo dopo aver legato lo scheletro stesso all resina per la sintesi su fase solida (SPPS). Finora è stata sviluppata solo una strategia Boc per la sintesi submonomerica, che consente di ottenere un elevato eccesso enantiomerico. Ai fini di ottenere nuovi PNA chirali, che rechino anche gruppi labili in ambiente acido, nuove strastegie sintetiche verranno utilizzate nei protocolli di sintesi su fase solida. Verranno introdotti gruppi protettori Fmoc-compatibili ai fini di applicare i protocolli comunemente utilizzati per la sintesi su fase solida con questa strategia. L’utilizzo della strategia Fmoc consentirà anche di utilizzare per la sintesi supporti solidi compatibili con l’esecuzione diretta di saggi biologici.
Infine verranno anche sintetizzati monomeri modificati di PNA arricchiti in isotopi 13C e 15N, in modo da incorporarli in filamenti di RNA che verranno usati dal gruppo di Napoli per studi NMR su duplex PNA-RNA.

2.2 PNA con nucleobasi modificate
Saranno preparate nucleobasi modificate capaci di interagire sia con legami ad idrogeno di tipo Watson-Crick che Hoogsteen, ai fini di combinare l’aumento di stabilità con l’aumento di specificità nel riconoscimento di nucleobasi. In base ai modelli molecolari di PNA-RNA sviluppati presso l’unità di Napoli, nucleobasi basate sulla struttura dei dimeri di uracile saranno modificate in modo da adattarsi ai duplex. Per il riconoscimento di RNA a doppio filamento, saranno sintetizzati PNA capaci di dare duplex PNA-RNA molto stabili, per favorire l’invasione della doppia elica di RNA. Inoltre, derivati dell’uracile saranno usati per ottenere un nuovo tipo di ribonucleasi artificiali basate sui PNA, utilizzando siti catalitici direttamente legati alle nucleobasi.

2.3 PNA modificati con gruppi fluorofori e/o gruppi ancoranti
Saranno sintetizzati PNA modificati con gruppi fluorofori che aumentino la loro fluorescenza in seguito alla complessazione dell’RNA (sonde switch-on). Inoltre, saranno anche progettati e sintetizzati PNA che rechino sulla stessa molecola un fluoroforo ed un quencher (PNA beacons). In assenza dell’RNA bersaglio, il beacon non è fluorescente, ma in seguito all’ibridazione con l’RNA bersaglio, il fluoroforo ed il quencher si allontanano, dando origine ad un segnale di fluorescenza. In questo modo si otterranno sonde “switch on” per test di rivelazione rapidi.
Con lo scopo di valutare le prestazioni dei PNA verso gli RNA con tecnologie microarray, verranno sintetizzati PNA modificati che rechino funzionalità utili per legarli covalentemente a superfici, in particolare PNA che rechino funzionalità amminiche (derivate dalla lisina) o carbossiliche (derivate dall’acido glutammico).


Task 3. Studio della complessazione di RNA a singolo e doppio filamento con PNA modificati

I PNA modificati saranno complessati con i loro RNA complementari antiparalleli e la stabilità dei duplex PNA-RNA verrà valutata tramite spettrofotometria Uv-Vis, dicroismo circolare, spettrometria di massa ESI ed esperimenti di gel shift. I PNA che daranno i duplex PNA-RNA più stabili verranno anche complessati con RNA contenenti mutazioni puntiformi, al fine di verificare la loro specificità. I PNA modificati nello scheletro o nelle nucleobasi, progettate come riportato nel Task 1, saranno utilizzati per il riconoscimento di RNA a singolo o a doppio filamento.
La capacità dei PNA di invadere duplex RNA sarà valutata con misure di temperatura di melting, dicroismo circolare, spettrometria di massa ESI, applicando metodologie già sviluppate nel gruppo di Parma. Saranno eseguiti anche esperimenti di gel shift per visualizzare la formazione di duplex PNA-RNA. Come bersagli a doppio filamento di RNA, saranno utilizzati siRNA di 20-22 basi, che mimino perfettament quelli usati per gli esperimenti di interferenza a RNA o quelli prodotti in maniera endogena (micro-RNA).
Per ottenere un’invasione efficiente, saranno valutati PNA di differente lunghezza con diversi RNA bersaglio. I PNA più adatti (in termini di modifiche ottimali, lunghezza e sequenza) saranno dati all’unità di Ferrara per essere testati su sistemi cellulari e all’unità di Napoli per studiare le strutture di duplex PNA-RNA, sia in soluzione mediante NMR sia allo stato solido mediante diffrattometria ai raggi X.


Task 4. Piattaforme diagnostiche per la rivelazione dell’RNA (inclusive delle procedure di amplificazione).

Saranno progettate e sintetizzate sonde a PNA con elevate proprietà di riconoscimento per strategie di rivelazione diverse. La principale strategia sarà quella di marcare i PNA con fluorofori selezionati o con sistemi fluoroforo/quencher, in modo da ottenere efficienti sonde “switch-on” (p.es. sonde LightUp, Molecular Beacons, FRET, etc.) che possano essere utilizzate per la rivelazione sensibile di RNA. I parametri che saranno presi in considerazione saranno lunghezza della sonda, temperatura di melting del duplex PNA-RNA, aumento di fluorescenza per legame con l’RNA complementare, selettività di sequenza. Le prestazioni di queste sonde saranno valutate su diverse piattaformrme diagnostiche (microarrays, HPLC, lettori multipozzetto, ecc.), principalmente combinate con strategie per l’amplificazione diretta dell’RNA.
Oltre ai metodi convenzionali per la rivelazione dell’RNA (p.es. RT-PCR), una particolare attenzione verrà posta sulle strategie di amplificazione isoterma nelle quali l’amplificazione degli acidi nucleici è eseguita senza cicli termici, evitando la necessità di strumentazioni speciali. Questi metodi offrono potenzialmente alcuni vantaggi sui sistemi basati sulla PCR, quali maggior velocità, miglior sensibilità e specificità, ridotti rischi di contaminazione e la possibilità di valutare la vitalità dei patogeni.
Obiettivi specifici del task saranno:
i) L’applicazione di strategie isoterme per la rivelazione di target specifici (norovirus, microrganismi patogeni).
ii) La progettazione e la sintesi di sonde a PNA fluorescenti da utilizzarsi per la rivelazione di acidi nucleici durante l’amplificazione isoterma. “Switching probes” come i PNA “Light up” descritti prima saranno usati per la rivelazione in fluorescenza in soluzione, e mediante misure Real Time.
iii) Le nuove sonde a PNA sviluppate in sistemi di amplificazione isoterma, saranno utilizzate al fine di ottenere metodi di rivelazione robusti ed efficienti per applicazioni in sistemi micro- e nano-.
iv) Sarà utilizzata la tecnologia microarray disponibile presso l’unità di Parma per la rivelazione dell’RNA. Saranno esplorate, in collaborazione con l’unità di Catania, nuove tecniche SPRI (surface plasmon resonance imaging) con sonde specifiche a PNA da utilizzarsi in sistemi microfluidici per la messa a punto di metodi di rivelazione molto sensibili, eventualmente tali da non richiedere una preventiva amplificazione dell’RNA.