RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - CHIMICA ORGANICA E INDUSTRIALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Emanuela Licandro

Descrizione

13.1 Programma di Ricerca
13.1.1 Introduzione
Il presente programma di ricerca si rivolge alla progettazione, realizzazione e caratterizzazione di nuovi monomeri ed oligomeri di PNA modificati secondo tre tipologie: i) variazione della catena pseudo-peptidica mediante l’utilizzo, per la sintesi degli oligomeri, di monomeri a struttura idrazinoetilglicinica (hydPNA) e amminoetilazaglicinica (azaPNA); ii) coniugazione di monomeri ed oligomeri di PNA con residui organometallici del renio, che possono fungere sia da sonde fluorescenti (applicazione in diagnostica) che da emettitori di radiazioni beta (applicazione in terapia); iii) coniugazione con nanoparticelle magnetiche di ferro per applicazioni in diagnostica e terapia. La realizzazione del progetto di sintesi consentirà all’U.R. di: 1) verificare le capacità, da parte dei PNA modificati sopra menzionati, di riconoscimento specifico di sequenze di RNA e miRNA; 2) dotare i PNA di sonde/nanoparticelle utili per un loro utilizzo in ambito diagnostico e terapeutico.
13.1.2 HydPNA e azaPNA
Riguardo le modifiche apportate alla catena pseudo-peptidica dei PNA, in letteratura sono state riportate numerose proposte di variazione per l’ottenimento di nuovi PNA più adatti ad applicazioni biotecnologiche e terapeutiche. Tuttavia ad oggi non sembra ci siano dati conclusivi riguardo a benefici, sulla specificità e stabilità, derivanti da particolari modifiche e quindi la ricerca al riguardo è ancora di elevato interesse. La presente U.R. ha acquisito, negli ultimi anni, una notevole competenza nella progettazione, realizzazione e caratterizzazione di due nuove classi di monomeri di PNA la cui struttura amminoetilglicinica è stata sostituita in un caso da una struttura idrazinoetilglicinica (hydPNA) e nell’altro caso da una struttura amminoetilazaglicinica (azaPNA). In questo secondo caso, il monomero contiene un gruppo carbazato [N-N-C(O)OR] al posto del residuo glicinico [N-CH2-C(O)OR]. Per entrambe le classi di derivati sopra menzionati sono stati così già preparati tutti i monomeri recanti le quattro basi nucleiche, e sono già stati avviati con successo studi volti a mettere a punto le condizioni di reazione più adatte per inserire tali monomeri in dimeri, trimeri o oligomeri superiori. Nel presente progetto ci si propone di utilizzare, in aggiunta al classico aegPNA, i suddetti nuovi monomeri per preparare nuovi oligomeri di PNA e di valutare le loro proprietà di binding (specificità e stabilità) con filamenti di RNA complementare. Pertanto i nuovi oligomeri preparati conterranno un numero variabile di monomeri di hydPNa o azaPNA alternati a monomeri di aegPNA. La presenza di unità di hydPNa e azaPNA potrebbe conferire utili ed interessanti proprietà chimico-fisiche agli oligomeri quali una maggiore solubilità in acqua ed una ridotta perdita in entropia nella formazione del duplex, grazie alla maggiore rigidità conferita alla catena del PNA dalla presenza del legame idrazidico, nel caso di hydPNA e amminoureico nel caso di azaPNA.
13.1.3 Coniugazione di monomeri ed oligomeri di PNA con complessi organometallici del renio.
Sono noti PNA coniugati con gruppi organometallici con proprietà fluorescenti, elettrochimiche o spettroscopiche, tuttavia gli studi in questo settore sono ancora piuttosto preliminari. La presente U.R. ha già sintetizzato alcuni monomeri ed oligomeri di PNA modificati con metalli di transizione per lo studio delle potenzialità di questi nuovi coniugati in diagnostica. L’Unità ha di conseguenza acquisito una certa esperienza nelle metodologie sintetiche necessarie per effettuare la coniugazione di residui organometallici a biomolecole e per la loro caratterizzazione sia spettroscopica che, nel caso di metalli elettrochimicamente attivi, elettrochimica. In questo progetto la U. R. si propone di legare al PNA complessi di renio a diversa struttura, per un potenziale utilizzo dei nuovi bioconiugati sia a scopo diagnostico che terapeutico. In letteratura è riportato un solo esempio di PNA legato ad un complesso bis-imidazolil tricarbonilico di Renio, di cui è stata studiata l’interazione con il DNA complementare; tuttavia nulla è stato in seguito pubblicato su bio-applicazioni di questo derivato. Per quanto riguarda i composti finalizzati all’uso in diagnostica, l’Unità studierà la coniugazione al PNA di complessi luminescenti di Re, mono e polinucleari, usando due diverse strategie: i) aggancio del PNA ai leganti protagonisti della transizione di trasferimento di carica coinvolta nel processo emissivo (di norma eterociclici azotati come bipiridine o diazine sostituite) oppure ii) uso del PNA come legante ancillare che si coordini direttamente sul metallo (ad esempio tramite i suoi terminali carbossilici). I nuovi bioconiugati verranno caratterizzati completamente, sia dal punto di vista spettroscopico che di luminescenza, al fine di verificare le loro potenzialità come sonde fluorescenti grazie alle peculiarità già ricordate della emissione dai complessi di Re. Per quanto riguarda le applicazioni radioterapeutiche, va ricordato che in letteratura sono state messe a punto procedure che consentono la preparazione rapida e in elevata purezza (condizioni indispensabili per lavorare con isotopi radioattivi di vita relativamente breve) di alcuni composti organometallici di renio, che sono stabili in soluzione acquosa e possono essere coniugati a un gran numero di biomolecole. L’Unità di Ricerca studierà l’aggancio di complessi organometallici di Re mono e binucleari, come [Re(CO)3(H2O)3]+ o [Re2(mu-OH)3(CO)6]-), a vari tipi di PNA, opportunamente funzionalizzati sulla catena peptidica. Questi nuovi oligomeri verranno caratterizzati tramite tecniche spettroscopiche e di essi si studieranno le caratteristiche di affinità di binding (specificità e stabilità) con sequenze complementari di RNA ed in particolare di microRNA. L’obiettivo, come in tutta la nuova generazione di radiofarmaci costituiti da complessi di metalli di transizione connessi a vettori biologici, è di veicolare il radioemettitore su specifici target. Si prenderà infine in esame la possibilità di utilizzare isotopi del Re radioattivi.
13.1.4 Nanoparticelle magnetiche di ferro modificate con PNA
Nell’ambito di questo progetto si studierà l’aggancio di monomeri ed oligomeri di PNA a nanoparticelle superparamagnetiche (SPIONs) costituite da un “core” di ferro e opportunamente funzionalizzate sulla superficie. Le SPIONs saranno preparate sia in solvente organico che in mezzo acquoso utilizzando le tecniche già disponibili in letteratura. In questo caso le SPIONs verranno dotate di un opportuno rivestimento che potrà essere ulteriormente modificato. In alternativa, sono commercialmente disponibili delle SPIONs nude, altamente monodisperse, pronte per essere funzionalizzate per silanizzazione. Queste nanoparticelle metalliche verranno coniugate con oligomeri di PNA. In questo modo, in linea di principio, sarà possibile realizzare la sintesi di strutture stabili ricoperte con differenti oligomeri di PNA da usare per applicazioni in diagnostica e terapia. Nell’ambito del presente progetto, l’Unità si propone di sintetizzare nanoparticelle SPIONS funzionalizzate con singoli filamenti di PNA, utilizzabili in esperimenti d’ibridizzazione con RNA complementari. L’avvenuto binding tra PNA e RNA potrà essere evidenziato attraverso la risonanza magnetica per immagini (MRI) e quindi questa metodologia, una volta messa a punto, potrà trovare applicazione nel campo nel riconoscimento genico.
13.2 Compiti dell’Unità di Ricerca
13.2.1 Introduzione
L’Unità di Ricerca è composta da ricercatori con competenze specifiche nella progettazione, sintesi e caratterizzazione, di composti organici, organometallici e di nanoparticelle magnetiche di ferro, ed ha acquisito una buona esperienza nella sintesi di monomeri, dimeri ed oligomeri di acidi peptido nucleici (PNA) modificati nello scheletro o coniugati con residui organometallici. Inoltre dispone di un sintetizzatore automatico e può preparare oligomeri di PNA. L’unità si occuperà della progettazione, sintesi, caratterizzazione di nuovi monomeri ed oligomeri di PNA [Punto 13.2.2], della loro coniugazione a complessi organometallici di renio [Punto 13.2.3] e del loro supporto su nanopaticelle magnetiche di ferro [Punto 13.2.4], in vista di applicazioni per il riconoscimento di sequenze complementari di RNA e microRNA.
13.2.2 Sintesi e caratterizzazione di nuovi dimeri ed oligomeri di hydPNA e azaPNA
Sulla base delle esperienze recentemente acquisite dall’Unità di Ricerca sulla sintesi di nuovi monomeri e dimeri di hydPNA e azaPNA recanti tutte e quattro le nucleobasi (A, G, C, T), si metterà a punto la sintesi di oligomeri misti (contenenti cioè sia i classici aegPNA che i nuovi hyd- e azaPNA) oppure omo-oligomeri di hydPNA e omo-oligomeri di azaPNA. In esperimenti preliminari sono già stati preparati dimeri e pentameri contenenti hyd- e azaPNA. I due atomi di azoto presenti negli hydPNA possono essere protetti ortogonalmente con benzilossicarbonile e tert-butossicarbonile. Ciò consente quindi una deprotezione selettiva e, utilizzando per l’oligomerizzazione la strategia Boc, sarà possibile accedere a due diversi tipi di oligomeri: uno che cresce sull’azoto esterno e uno su quello interno del gruppo idrazinico. Nel primo caso si otterrebbero omo-oligomeri con unità ripetitive di sette atomi; nel secondo caso, l’unità ripetitiva sarebbe di sei atomi come in aegPNA. In entrambi gli oligomeri ottenuti, nel backbone sarà presente un gruppo amminico in più rispetto all’aegPNA. L’inserzione invece di monomeri di azaPNA in oligomeri di aegPNA o la loro oligomerizzazione, prevede l’utilizzo di una reazione di addizione tra un isocianato, derivante dal gruppo amminico terminale del backbone di aeg- o azaPNA, e il gruppo amminico del residuo idrazidico dell’ azaPNA. Infatti, la idrolisi del gruppo N-acil-carbazato [RC(O)N-NH-C(O)OR’], necessaria a liberare la funzione carbossilica per la successiva reazione di coupling, avviene con contemporanea decarbossilazione, lasciando quindi sulla molecola di azaPNA un residuo idrazidico [RC(O)N-NH2]. I nuovi oligomeri verranno purificati mediante RP-HPLC e caratterizzati mediante ESI e MALDI e, in collaborazione con l’Unità di Ricerca di Napoli, studiati dal punto di vista spettroscopico. In collaborazione con l’Unità di Ricerca di Parma, si effettueranno quindi prove di binding con filamenti di RNA e microRNA complementari.
13.2.3 Sintesi e caratterizzazione di coniugati di monomeri ed oligomeri di PNA con complessi organometallici del renio
L’Unità di Ricerca, in collaborazione con il gruppo del Prof. Giuseppe D’Alfonso (Università di Milano) ha già verificato la possibilità di coniugare complessi organometallici binucleari del Re ad un monomero di aegPNA esplorando due diverse strategie: i) una reazione di coupling tra il gruppo amminico libero del monomero di aegPNA e il gruppo carbossilico presente su un legante diazinico del complesso binucleare del Re; ii) uso del PNA come legante ancillare che è stato coordinato direttamente sul metallo tramite il gruppo carbossilico.
Il compito dell’Unità di Ricerca dunque prevede la messa a punto delle metodiche sopra riportate e la completa caratterizzazione dei nuovi complessi ottenuti tramite tecniche spettroscopiche (NMR, IR, UV-vis) e spettrometria di massa ESI e MALDI, per stabilire l’avvenuta coniugazione, il/i sito/i di legame e possibilmente la struttura in soluzione. Si cercherà anche di ottenere cristalli singoli che consentano la determinazione strutturale in solido. Una volta messa a punto la metodologia sintetica sopra descritta, si procederà alla coniugazione dei complessi di Re a oligomeri di aegPNA. Questo verrà realizzato utilizzando le due strategie riportate all’inizio del paragrafo. In particolare, si prepareranno inizialmente gli oligomeri in fase solida (sia manualmente che con sintetizzatore automatico), attaccando all’ultimo monomero uno spaziatore che termini con un gruppo amminico (ad esempio l’acido 1-amminoesanoico o l’acido amminoetossi-etossi acetico, AEEA) e, dopo distacco dalla resina dell’oligomero, si aggancerà il complesso di Re tramite il gruppo carbossilico presente su uno dei suoi leganti, utilizzando una reazione di coupling. Con la seconda metodologia l’oligomero di aegPNA, al quale verrà attaccato uno spaziatore che termini con un gruppo carbossilico, verrà direttamente coordinato all’atomo di metallo del complesso di Re tramite il gruppo carbossilico stesso. Gli oligomeri coniugati verranno purificati tramite HPLC e caratterizzati mediante tecniche spettroscopiche (IR, UV-vis) e di spettrometria di massa ESI e MALDI. Da ultimo, verranno effettuate prove di binding tra i nuovi coniugati del PNA con il Re e filamenti complementari di RNA e miRNA.
13.2.4 Sintesi e caratterizzazione di PNA supportati su nanoparticelle magnetiche di Fe
L’Unità di Ricerca, in collaborazione con il gruppo del Dr. Davide Prosperi (CNR, Milano) ha già verificato la possibilità di supportare monomeri di aegPNA su nanoparticelle magnetiche di Fe esplorando due strategie: i) reazione, in ambiente basico, tra particelle di gamma-ferrite (gamma-Fe3O4) della dimensione di 10 nm con monomeri di aegPNA avente la funzione carbossilica libera: in questo modo il carbossilato generatosi coordina gli atomi di ferro ancorandosi alla superficie della nanoparticella; ii) reazione tra particelle di gamma-ferrite (gamma-Fe3O4) e un monomero di aegPNA funzionalizzato con un gruppo silossano che può legarsi agli atomi di ossigeno della nanoparticella. Il compito della U.R. prevede la messa a punto delle metodiche sopra riportate e la completa caratterizzazione dei nuovi sistemi nanoparticella di ferro-monomero di PNA ottenuti tramite tecniche spettroscopiche (NMR, IR, UV-vis), light scattering dinamico, microscopio elettronico a trasmissione (TEM), spettrometria di emissione atomica (ICP-AES). Queste tecniche spettroscopiche ed analitiche sono quelle comunemente usate per la caratterizzazione di nanoparticelle e questo aspetto verrà particolarmente curato dalla U.R. in quanto tutta la strumentazione necessaria è disponibile nelle strutture universitarie di Milano. Una volta messe a punto le metodologie sintetiche sopra descritte, l’Unità procederà all’aggancio di oligomeri di aegPNA alle nanoparticelle di ferro. Questo verrà realizzato utilizzando le due strategie riportate all’inizio del paragrafo. In particolare, si prepareranno inizialmente gli oligomeri di PNA in fase solida (sia manualmente che con sintetizzatore automatico), attaccando all’ultimo monomero dell’oligomero uno spaziatore che termini con un gruppo carbossilico e, dopo distacco dalla resina ed eventuale purificazione via RP-HPLC, l’oligomero ottenuto verrà messo a reagire, in ambiente basico, con le nanoparticelle. In alternativa, dopo distacco dalla resina, l’oligomero, purificato per RP-HPLC, verrà prima funzionalizzato, in soluzione, con il residuo silossanico e successivamente messo a reagire con le nanoparticelle di ferro. I nuovi sistemi [PNA]-[Fe3O4] verranno caratterizzati tramite le tecniche spettroscopiche ed analitiche sopra menzionate. Infine, verranno effettuate prove di binding tra i nuovi sistemi [PNA]-[Fe3O4] e filamenti complementari di RNA e miRNA.
13.2.5 Collaborazioni con le altre unità di ricerca
Studi di modellistica molecolare e strutturali (spettroscopia NMR e raggi-X) su dimeri e oligomeri di hydPNA e azaPNA, che sono già parzialmente in atto verranno condotti in collaborazione con l’Unità di Ricerca di Napoli, mentre, in collaborazione con l’Unità di Ricerca di Parma (collaborazione già in atto), si effettueranno studi di stabilità di binding. In collaborazione con l’Unità di Ricerca di Ferrara in intraprenderanno studi biologici su cellule dei nuovi oligomeri sintetizzati.