RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi

Università di riferimento

Consiglio Nazionale delle Ricerche - Istituto di biostrutture e bioimmagini - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Michele Saviano

Descrizione

Gli acidi peptido nucleici (PNA) sono analoghi oligonucleotidici in cui lo scheletro zucchero-fosfato è stato sostituito da uno scheletro pseudo-peptidico. Questi composti mostrano alta stabilità sia ad acidi e basi forti, sia all'attacco di enzimi quali le nucleasi e le proteasi. I PNA legano filamenti complementari di RNA e DNA con alta affinità e specificità, formando sia doppi che triple eliche. Queste caratteristiche rendono i PNA degli strumenti interessanti in tutti gli approcci che coinvolgono il targeting di acidi nucleici.
Allo scopo di sviluppare molecole basate sul PNA per il targeting all'RNA, nel presente progetto saranno affrontati i seguenti argomenti: 1) la progettazione di nuovi monomeri di PNA e di coniugati di PNA, 2) la progettazione e la sintesi di oligomeri di PNA, di oligomeri modificati di PNA e coniugati 2’ OMe-PNA per l'inibizione di miRNA; 3) la progettazione e la sintesi di oligomeri di PNA per il targeting a mRNA per il quale è presente una variante di "splicing" ed in particolare per direzionale il pathway di maturazione dell'RNA nella forma di splicing aberrante della IVS110 β globina; 4) la caratterizzazione strutturale di doppie eliche costituite da oligomeri modificati di PNA ibridizzati a PNA e RNA complementari.

La ricerca si articolerà nelle seguenti fasi:
Fase 1. Molecular Design e simulazioni di dinamica molecolare di coniugati di PNA.
Mediante una dettagliata analisi condotta sui dati strutturali e chimico-fisici disponibili in letteratura, saranno disegnati nuovi monomeri di PNA per le applicazioni diagnostiche e terapeutiche definite dalle altre U.O (Parma e Milano). Questa prima fase di progettazione sarà eseguita con tecniche di "computer modelling" e di minimizzazione di energia utilizzando e/o sviluppando opportuni campi di forza "ab initio". In particolare, si intende modificare il backbone peptidico e/o i sostituenti in catena laterale in modo da ottimizzare l'interazione con le sequenze di acidi nucleici bersaglio proposte dall’U.O. in Ferrara Inoltre, si intendono disegnare dei coniugati di PNA con DNA e peptidi. I coniugati PNA-DNA saranno progettati con lo scopo di ottenere reagenti di grande interesse da utilizzare in terapia genica, con migliori proprietà di: a) interazione con le molecole bersaglio (proteine, RNA); b) stabilità; c) di trasporto e d) di effetti biologici su culture cellulari I coniugati PNA-peptidi saranno progettati utilizzando peptidi anfipatici per incrementare l'uptake cellulare di PNA.
Per analizzare il comportamento strutturale e dinamico di duplex tra RNA e PNA modificati in soluzione acquosa saranno condotte simulazioni di dinamica molecolare. Come modelli di partenza saranno utilizzati sia la struttura NMR del duplex PNA-RNA sia quella raggi-X del duplex DNA-D-lisina PNA. In tutti i casi i differenti filamenti di PNA, con monomeri modificati o coniugati a DNA o peptidi, saranno generati sostituendo in modo opportuno gli atomi e i gruppi di atomi, utilizzando previsioni geometriche sulla loro topologia locale, le coordinate degli atomi più vicini legati e dati di letteratura. I modelli saranno quindi minimizzati, tenendo fisse le coordinate delle basi azotate. Quindi saranno eliminati tutti i restraints introdotti e sarà eseguita una ulteriore minimizzazione di energia. Le strutture risultanti saranno, quindi, usate per tutte le seguenti simulazioni di Dinamica Molecolare. Per tutte le simulazioni, saranno utilizzati duplex PNA-RNA sia in forma A: sia nella forma di "P-helix" Ogni sistema verrà modellato con il campo di forze AMBER95 [1]. Le simulazioni saranno effettuate utilizzando il programma GROMACS [2] e i risultati saranno comparati con analoghe simulazioni di duplex PNA-RNA e RNA-DNA[3]. In dettaglio i duplex saranno immersi in un box parallelepipedo riempito con molecole d'acqua TIP3P [4], imponendo una distanza minima tra il soluto e la parete della scatola di 10 Å. Il sistema sarà composto da circa 100000 atomi che saranno simulati in condizioni periodiche di legame, usando un raggio di cut-off di 9 Å per le interazione di coppia e aggiornando la lista dei vicini ogni 10 passi. Le interazioni elettrostatiche verranno calcolate con il metodo Particle Mesh Ewald [5-6]. L'algoritmo SHAKE [7] verrà usato per vincolare tutti i legami. Dopo un iniziale equilibratura di circa 250 ps, una tipica traiettoria di simulazione di 1/2 ns verrà eseguita ud una temperatura costante di 300 K usando il metodo di Berendsen [8] ed alla pressione costante di un bar, con un passo di 2 fs. Le costanti di accoppiamento per la pressione e la temperatura saranno di 0.5 ps.
Le simulazioni genereranno una grande quantità di dati che saranno analizzati seguendo le procedure descritte in lavori precedenti [9-14]. Tutte le altre analisi, come l'analisi delle componenti principali del moto ed il calcolo di parametri d'ordine, saranno realizzate con il pacchetto di dinamica GROMACS [2].
Queste metodiche potranno portare allo sviluppo di PNA con nuove proprietà strutturali e accresciute funzionalità da utilizzare in applicazioni di biologia molecolare e di diagnostica, Questi dati risultano fondamentali per la comprensione delle forze in gioco nell'interazione e per la progettazione dei coniugati di PNA con le caratteristiche desiderate di specificità e selettività.

Fase 2 Sintesi di PNA e di analoghi di PNA
L’inibizione dei miRNA da parte di PNA non è stata ancora dimostrata. A tale scopo saranno proposti due approcci:
2a) uso di sequenze di PNA o analoghi di PNA complementari al miRNA target;
2b) inibizione della interazione tra il pre-miRNA e la nucleasi Dicer mediante PNA, 2’-OMe e coniugati PNA-2’OMe che assemblano in strutture ad hairpin.
2a) Oligomeri di PNA per l’inibizione di miRNA coinvolti nella differenziazione e nel cancro saranno ottenuti. Saranno progettate e sintetizzate sequenze della lunghezza di 12-14 basi complementari al miRNA bersaglio. Le sintesi saranno effettuate in fase solida, su un sintetizzatore automatico Expedite 8909. Saranno utilizzati protocolli standard o modificati per la sintesi su scala 2 µmol. Saranno utilizzati monomeri protetti con gruppi Bhoc sulle funzioni amminiche esocicliche e gruppi Fmoc sulle funzioni amminiche terminali. Tutti gli accoppiamenti saranno eseguiti con l’agente accoppiante HATU, in presenza di basi quali DIPEA e lutidina. Le reazioni di capping saranno eseguite con soluzioni di anidride acetica in DMF; i gruppi Fmoc saranno rimossi per trattamento con soluzioni di piperidina al 20% in DMF. Gli oligomeri saranno bloccati alle estremità mediante acetilazione o reazione con piccole molecole. Gli oligomeri di PNA protetti saranno distaccati e deprotetti mediante trattamento con TFA in presenza di opportuni scavenger, quali m-cresolo. Gli oligomeri saranno purificati mediante HPLC e caratterizzati mediante analisi di massa elettrospray.
Saranno utilizzati anche monomeri di PNA modificati. Ad esempio, monomeri con gruppi idrossimetile in posizione ?; dello scheletro saranno inseriti in oligomeri di PNA. Coniugati PNA-DNA, in cui il DNA è legato all’estremità N-terminale del PNA saranno sintetizzati, utilizzando protocolli standard [10].
2b) La struttura raggi X dell’enzima Dicer complessato ad un RNA target sarà analizzata [15], in modo da evidenziare quali amminoacidi di Dicer sono coinvolti nel contatto con l’RNA. Una volta determinata la superficie di contatto tra la proteina e l’acido nucleico, saranno progettati i nuovi hairpin. Poiché il riconoscimento dei pre-miRNA da parte di Dicer dipende fortemente dalla struttura degli hairpin, saranno introdotte nei nuovi hairpin modifiche che non ne alternano la struttura. Saranno prese in considerazione modifiche sullo scheletro che stabilizzano le interazioni enzima-substrato, ad esempio saranno introdotti gruppi capaci di formare legami a idrogeno o fornire interazioni carica-carica.

Le sequenze degli oligomeri di PNA per il targeting a mRNA per il quale è presente una variante di "splicing" ed in particolare per direzionale il pathway di maturazione dell'RNA nella forma di splicing aberrante della IVS110 β-globina saranno definite in collaborazione con l'U.O di R.U. in Ferrara
Le sintesi dei PNA saranno eseguite in fase solida su sintetizzatore automatico. Per la sintesi dei coniugati di PNA, saranno testate due strategie: sintesi “on line” e assemblaggio di due frammenti sintetizzati separatamente. I protocolli di sintesi “on line” saranno stabiliti dopo un’attenta analisi dei gruppi protettori permanenti sui diversi monomeri che devono essere assemblati. Saranno scelti monomeri aventi gruppi protettori stabili durante il corso della sintesi e che potranno essere rimossi contemporaneamente nella fase di distacco.
L’assemblaggio di due frammenti per dare un coniugato può essere realizzato in fase solida e in soluzione. La strategia in fase solida richiede che un frammento sia immobilizzato su una resina e messo a reagire con un secondo frammento completamente protetto. Questa strategia consente l’uso di larghi eccessi del frammento protetto per spingere la reazione a completezza; inoltre il processo di purificazione risulterà semplificato, in quanto solo l’oligomero coniugato e quella immobilizzato sulla resina saranno nella miscela di reazione.
L’assemblaggio in soluzione può essere effettuato utilizzando molecole non protette, mediante reazioni chemoselettive. Saranno testate reazioni tra gruppi tiolici appartenenti ad un frammento e derivati alogenidrici del secondo frammento. In alternativa, reazioni di chemical ligation tra cisteine N-terminali di un frammento e tioesteri C-terminali di un altro frammento saranno studiate.
Tutti i prodotti saranno purificati mediante HPLC e caratterizzati mediante analisi di massa elettrospray. Gli oligomeri e i coniugati puri saranno forniti all’U.O. di Ferrara per i saggi biologici, all'U.O. di Catania per gli esperimenti di Surface Plasmon Resonance e saranno utilizzati per la caratterizzazione strutturale mediante CD e raggi X.

Fase 3 Caratterizzazione in soluzione e allo stato solido
3a) Caratterizzazione chimico-fisica in soluzione
I sistemi ottenuti nella fase 2 e quelli sintetizzati dalle U.O. di Parma e Milano saranno caratterizzati in soluzione utilizzando tecniche di Dicroismo Circolare, Spettrofluorimetria e Risonanza Magnetica Nucleare, in modo coordinato con l'U.O. di Parma. In particolare, la variazione delle grandezze termodinamiche e i riarrangiamenti strutturali ,conseguenti alla formazione dei complessi PNA/PNA, e PNA/RNA in formazione di doppie eliche, saranno seguiti mediante tecniche di dicroismo circolare a temperatura variabile. Opportune procedure di deconvoluzione degli spettri ottenuti forniranno inoltre le prime indicazioni di carattere strutturale.
Approfonditi studi strutturali in soluzione per determinare la struttura tridimensionale di tali complessi saranno effettuati con tecniche di risonanza magnetica nucleare mono e bidimensionale combinate con metodiche di "Distance Geometry". In particolare, ci si propone di eseguire esperimenti in diversi sistemi solvente, mettendo anche a punto sequenze mono e bidimensionali. Questi esperimenti consentiranno sia di avere dati strutturali, sia di valutare le costanti di binding dei complessi, in modo da poter comparare questi risultati con quelli ottenuti dalle precedenti tecniche spettroscopiche. Le distanze interprotoniche (NOE), le costanti di accoppiamento, i coefficienti di temperatura saranno infine utilizzati in programmi di Distance Geometry per la costruzione di modelli tridimensionali.
3b) Studi strutturali mediante tecniche di diffrazione di raggi-X.
La caratterizzazione strutturale dei complessi sarà eseguita allo stato solido effettuando esperimenti di cristallizzazione delle molecole di PNA e dei complessi PNA-DNA e PNA-RNA, in condizioni controllate di pH e di temperatura in vari sistemi tampone. Una volta ottenuti cristalli adatti, saranno eseguite raccolte di dati di diffrazione di raggi-X anche a bassa temperatura, utilizzando un diffrattometro anodo rotante con image plate. Quindi, si procederà alla risoluzione della struttura con diverse tecniche ed approcci metodologici, e al successivo raffinamento di tali dati. I dati strutturali ottenuti saranno di grandissima utilità per la verifica dei dati di progetto e per ottenere nuovi monomeri sintetici.
In tutti i casi in cui non sarà sufficiente per la raccolta dati la potenza fornita dal generatore anodo rotante a disposizione dell'U.O di Napoli, si utilizzerà tempo macchina presso le linee di luce di sincrotone di Trieste e Grenoble.
Tutti i dati strutturali delle analisi condotte saranno quindi messi in relazione con i risultati degli screening biologici, in modo da verificare i dati di progettazione e disegnare nuovi monomeri e coniugati di PNA di interesse diagnostico e terapeutico.


Refimenti bibliografici
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