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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano
Bibliografia
[1] Jörg D. Hoheisel, Nature Reviews | Genetics 2006, 7, 200-210.
[2] Syvanen A. C. Nat. Rev. Genet. 2001, 2, 930-942.
[3] Kirk B. W., Feinsod, M., Favis, R.; Kliman, R. M., Barany, F., Nucleic Acids Res. 2002, 30, 3295-3311.
[4] Xu Jia, Zhu, Shuifang, Miao, Haizhen, Huang, Wensheng, Qiu, Minyan; Huang, Yan; Fu, Xuping; Li, Yao ,Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007, 55, 5575-5579.
[5] Germini A., Rossi, S. Zanetti A., Corradini R., Fogher C., Marchelli R., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005, 53, 3958-3962.
[6] Lehr H. P., Reimann M., Brandenburg A., Sulz G., Klapproth H., Anal. Chem. 2003, 75, 2414-2420.
[7] Thierry L., Maillart E., Lassalle N., Mailley P., Corso B., Guedon P., Roget A., Levy Y., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2003, 32, 687-696.
[8] Rothenhäusler B. and Knoll W., Nature 1988, 332, 615.
[9] Lee J. H., Wark A. W., Corn R. M., Langmuir 2006, 22, 5241-5250.
[10] Nelson B. P., Grimsrud T. E., Liles M. R., Goodman R. M., Corn R. M., Anal. Chem. 2001, 73, 1-7.
[11] Wegner G. J., Wark A. W., Lee H. Jin, Codner E., Saeki T., Fang S., Corn R. M., Anal. Chem. 2004, 76, 5677-5684.
[12] Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M., Anal. Chem. 2006, 78, 6504-6510.
[13] D’Agata R., Grasso G., Iacono G., Spoto G., Vecchio G., Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 610–612.
[14] Lee H. J., Goodrich T. T., Corn R. M., Anal. Chem. 2001, 73, 5525-5531.
[15] Kanda V., Kariuki, J. K., Harrison D. J., McDermott M., Anal. Chem. 2004, 76, 7257-7262.
[16] Wang Z., Wilkop T., Xu D., Dong Y., Ma G., Cheng Q., Anal Bioanal Chem 2007, 389, 819-25.
[17] Grasso G., Fragai M., Rizzarelli E., Spoto G., Yeo K. J., J. Mass Spectrom. 2006, 41, 1561–1569.
[18] Squires T. M., Quake S. R., Reviews of modern physics, 2005, 77, 978-1026.
[20] He L., Musick M. D., Nicewarner S. R., Salinas F. G., Benkovic S. J., Natan M. J., Keating C. D., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9071-9077.
[21] Kubitschko, S., Spinke, J., Bruckner, T., Pohl, S., Oranth, N., Anal. Biochem. 1997, 253, 112-122.
[22] Wink T., van Zuilen S. J., Bult A., van Bennekom, W. P., Anal. Chem. 1998, 70, 827-832.
[23] Jordon C. E., Frutos A. G., Thiel A. J., Corn R. M. Anal. Chem. 1997, 69, 4939-4947.
[24] Liu J., Tian S., Tiefenauer L., Nielsen P. E., Knoll W., Anal. Chem. 2005, 77, 2756-2761.
[25] Fang, S., Lee, H. J., Wark, A. W., Corn, R. M., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14044-14046.
[26] Taton T. A., Mirkin C. A., Letsinger R. L., Science 200, 289, 1757-1760.
[27] Reichert J., Csaki A., Kohler J. M., Fritzsche W., Anal. Chem. 2000, 72, 6025-6029.
[28] Niemeyer C. M., Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4128 -4158.
[29] Li Y., Wark A. W., Lee H. J., R. M. Corn, Anal. Chem. 2006, 78, 3158-3164.
[30] Fumio M. N., Akira B., Kaoru T., Hirobumi U., Aaron L. K. H., Abhijit M., Wolfgang K., Journal of Physical Chemistry C 2007, 111, 11653-11662.
[31] Yao X., Li X., Toledo F., Zurita-Lopez C., Gutova M., Momand J., Zhou F., Anal. Biochem. 2006, 354, 220-228.
[32] Nielsen P. E., Acc. Chem. Res. 1999, 32, 624-630.
[33] Corradini R., Sforza S., Tedeschi T., Marchelli R., Chirality 2007, 19, 269-294.
[34] Dueholm, K. L., Nielsen, P. E., New J. Chem. 1997, 21, 19-31.
[35] Nielsen P., Quarterly reviews of biophysics 2005, 38, 345-50.
[36] Nielsen P.E ., Molecular biotechnology 2004, 26, 233-48.
[37] Gao Z., Agarwal A., Trigg A. D., Singh N. Fang, Cheng T., C.-H. F. Yi, Buddharaju K. D., Kong J., Anal. Chem. 2007, 79, 3291-3297.
[39] Weiler J., Gausepohl H., Hauser N., Jensen O. N., Hoheisel J. D., Nucleic Acid Res. 1997, 25, 2792-2799.
[40] Li-Qiang C., Foerch R.., Knoll W. Angewandte Chemie, 2007, 46, 4944-4947.
[41] R. Gambari, Current Pharmaceutical Design, 2001, 7, 1839-1862.
[42] Liu J., Tiefenauer L., Tian S., Nielsen P. E., Knoll W. Anal. Chem.2006, 78, 470-476.
[43] Kambhampati D; Nielsen P E; Knoll W., Biosensors & bioelectronics 2001, 16, 1109-18.
[44] Rossi S., Scaravelli E., Germini A., Corradini R., Fogher C., Marchelli R. European Food Research and Technology 2006, 223,1-6.
[45] Corradini R., Feriotto G., Sforza S., Marchelli R., Gambari R. Journal of Molecular Recognition 2004, 17, 76-84.
[46] Feriotto G., Breveglieri G., Finotti A., Gardenghi S., Gambari R., Lab. Invest. 2004, 84, 796-803.
[47] Knoll W., Park H., Sinner E.K., Yao D., Yu F., Surface Science 2004, 570, 30-42.
[48] Liu J., Tian S., Tiefenauer L., Nielsen P. E., Knoll W., Anal. Chem. 2005, 77, 2756-2761.
[49] Liu J., Tiefenauer L., Tian S., Nielsen P. E., Knoll W.,Anal. Chem. 2006, 78, 470-476.
[50] D’Agata R., Spoto G., Corradini R., Marchelli R., Surface Plasmon Resonance Imaging and Microchannel Sensing for Hybridization Detection of PNA Probe and DNA Target Oligomers, XX Congresso Nazionale di Chimica Analitica 16 - 20 Settembre 2007, Viterbo.

Programma di ricerca

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi
Università di riferimento
Università degli Studi di CATANIA - SCIENZE CHIMICHE - ()
Responsabile dell'Unità di ricerca
Giuseppe Spoto
Descrizione
L’U.R. di Catania si dedicherà allo sviluppo di nuovi metodi basati sull’SPRI utili alla rivelazione in parallelo dell’ibridazione di target di RNA e microRNA (miRNA) da parte di probe di PNA. A tale scopo verranno utilizzati dei dispositivi microfluidici per il trasporto parallelo di minime quantità di specie reagenti e per fare in modo che le reazioni sulla superficie vengano condotte con controllo spaziale.
Il recente grande interesse mostrato verso i miRNA[1-3] ha anche stimolato l’esigenza di mettere a punto metodi altamente sensibili da utilizzarsi per la rivelazione di miRNA da parte di microarray di DNA.[4] Purtroppo però la diretta ibridazione di miRNA presenta dei problemi connessi alle loro ridotte dimensioni. Recentemente è stato dimostrato come sia possibile, operando delle modifiche chimiche o enzimatiche del miRNA, abbassare il limite di rivelabilità a valori di concentrazioni di miRNA pari a circa 10fM.[5]
E’ noto come i PNAs siano in grado di migliorare sia la selettività che la sensibilità del riconoscimento di sequenze complementari di RNA e miRNA.
Su queste basi l’attività di ricerca sarà finalizzata al raggiungimento dei seguenti risultati:

1-Progettazione ed ottimizzazione di procedure basate sulla microfluidica per l’immobilizzazione spazialmente controllata di PNAs.
Il comportamento dei fluidi in condizioni di microfluidica differisce da quello osservato nel mondo macroscopico.[6] In generale, esso è tale da risultare vantaggioso per condurre esperimenti SPRI in parallelo. In regime microfluidico la viscosità prevale sulle forze d’inerzia cosicché il flusso del liquido procede in maniera laminare. Inoltre il trasporto di massa è controllato dalla diffusione e non dai moti convettivi.
Verranno realizzati dispositivi microfluidici a differenti geometrie facendo uso di poli(dimetilsilossano) (PDMS) e master in polivinil cloruro (PVC). In particolare si studieranno i vantaggi offerti dall’uso di dispositivi microfluidici con microcanali a Y rispetto a quelli basati su microcanali paralleli. Inoltre verranno studiate geometrie più complesse allo scopo di comprenderne i vantaggi nello sviluppo di approcci paralleli nella rivelazione di target di RNA mediante SPRI.

2- Progettazione ed ottimizzazione di procedure per la fabbricazione dell’interfaccia tra la superficie di oro e i probe a PNA.
I sistemi molecolari utilizzati nella regione di interfaccia verranno immobilizzati sulla superficie di oro attraverso gruppi tiolo/solfuro/disolfuro e interagiranno con i probe a PNA attraverso gruppi N-idrossosuccinimidil estere o streptavidina. Verrà individuato il più opportuno grado di ricoprimento della superficie che consentirà di minimizzare possibili interazioni tra i singoli siti reattivi nel corso delle reazioni di ibridazione. Inoltre la regione d’interfaccia verrà progettata in modo da minimizzare fenomeni di interazione non specifica. Si farà anche uso di strumenti di dinamica molecolare per meglio individuare le migliori architetture di superficie utili a condurre gli esperimenti di interazione PNA:RNA.
Per gli esperimenti verranno utilizzati dei probe a PNA ammino-terminali o biotinilati. Questi verranno forniti della U.R. di Parma e Napoli.

3- Progettazione ed ottimizzazione di procedure per l’amplificazione della risposta SPRI all’ibridizzazione di RNA e miRNA con sonde PNA
In questa fase dell’attività di ricerca l’attenzione verrà rivolta alla sensibilità del SPRI nella rivelazione delle ibridazioni PNA:RNA e PNA:miRNA. I metodi di amplificazione che verranno utilizzati faranno fondamentalmente uso di nanoparticelle di oro (AuNPs) opportunamente funzionalizzate. In particolare, nel caso della rivelazione di miRNA verrà investigata una procedura in cui una sequenza di poli(A) verrà aggiunta al miRNA ibridizzato con il probe a PNA immobilizzato sulla superficie. Ciò avverrà facendo ricorso ad una reazione di superficie di polimerasi poli(A). La coda di poli(A) così aggiunta verrà ibridata con un sistema di AuNPs funzionalizzate con un poli(T)-DNA. Tale ibridazione dovrà essere causa dell’amplificazione del segnale SPRI.
Le U.R. di Parma e Ferrara collaboreranno all’ottimizzazione delle procedure e alla identificazione di eventuali metodi alternativi.

4-Confronto del metodo SPRI sviluppato con il metodo di rivelazione basato sulla fluorescenza.
I risultati ottenuti utilizzando l’SPRI verranno confrontati con quelli ottenuti, presso l’U.R. di Parma, con metodi basati sulla fluorescenza utilizzando sequenze PNA comuni.


[1]Pasquinelli, A. E., Hunter, S. Bracht, J., Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 200–205 (2005).
[2] Lin He and Gregory J. Hannon, Nature Reviews:Genetics 5, 2004, 522-531.
[3] George A. Calin and Carlo M. Croce, Nature Reviews: Cancer, 6 2006, 857-866.
[4] J. Shingara, K. Keiger, J. Shelton, W. Laosinchai-Wolf, P. Powers, R. Conrad, D. Brown, E. Labourier, RNA (2005), 11:1461–1470.
[5] Shiping Fang, Hye Jin Lee, Alastair W. Wark, and Robert M. Corn, J. Am. Chem. Soc., 128 (43), 14044 -14046, 2006.
[6] T.M. Squires, S.R. Quake, Rev. Mod. Phys. 77 (2005) 977-1026.