RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi

Università di riferimento

Università degli Studi di FERRARA - BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Roberto Gambari

Descrizione

PIANO SPERIMENTALE

OBIETTIVI

Gli obiettivi della RU Gambari sono i seguenti:

Obiettivo specifico 1: valutare l’attività biologica di molecole basate sui PNA aventi come bersaglio i microRNA o che mimano l’attività dei microRNA.

Obiettivo specifico 2: valutare l’attività biologica delle molecole basate sui PNA sviluppate per mimare l’attività siRNA e aventi come bersaglio i precursori di RNA nucleare (bersagli: RNA non processato; RNA multi-processato).

Obiettivo specifico 3: valutare l’attività di molecole basate sui PNA che mimano l’attività siRNA e che hanno come bersaglio mRNA maturi: (a) mRNA per i fattori di trascrizione; (b) mRNA anti-apoptotici; (c) RNA virali.

Obiettivo specifico 4: analisi di sonde PNA per la rilevazione di RNA virale in protocolli diagnostici (in collaborazione con la RU Marchelli).

Il disegno e la caratterizzazione chimica dei PNA e dei relativi analoghi saranno attuati dalla RU Saviano (Napoli). Lo sviluppo di nuovi monomeri per creare analoghi dei PNA sarà realizzato dalle RU Marchelli (Parma) e RU Licandro (Milano). Lo sviluppo di nuovi test HTS basati sulla tecnologia SPR sarà attuato dalla RU Spoto (Catania).

Il progetto è diviso nei seguenti Task:

Task 1: microRNA come bersaglio. Al fine di interferire con i miRNA, saranno adottati due differenti approcci: (i) sviluppo di PNA in grado di interagire e di inibire direttamente con i miRNA e/o con i loro precursori e (ii) disegno e sintesi di PNA che mimano la struttura di miRNA maturi e che competono con essi. Gli esperimenti saranno condotti usando molecole basate sui PNA che mimano l’attività biologica dei miRNA.

(a) miRNA coinvolti nel differenziamento eritroide come bersaglio.

Questa parte del progetto si basa sul fatto che i miRNA, come i miRNA 155, 221 e 222 sono espressi in cellule eritroidi (Georgantas e al. 2007). Noi proponiamo di usare come bersaglio questi microRNA per alterare l’espressione genica di cellule eritroidi. L’alterazione dell’espressione genica sarà analizzata mediante la tecnica RNA-arrays (Mischiati e al.,2006). Al fine di dimostrare l’attività delle molecole anti-miRNA basate sui PNA, noi utilizzeremo due sistemi cellulari, la linea cellulare umana leucemica K562 indotta al differenziamento mediante trattamento con opportuni induttori (come mitramicina, psoraleni, butirrati, rapamicina) (Mischiati et al., 2004b) e colture in due fasi liquide di progenitori eritroidi umani isolati da donatori sani (Fibach e al., 2003; Fibach e al., 2006; Gambari e Fibach, 2007). I progenitori eritroidi saranno isolati da (a) soggetti sani e (b) pazienti affetti da beta-talassemia che mostrano differenti livelli di base di emoglobina fetale (HbF) prodotta (Fibach e al., 2003). Le cellule mononucleari saranno isolate tramite centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Hypaque e coltivate in terreno condizionato isolato dalla linea cellulare di carcinoma di vescica 5637. Dopo 7 giorni di incubazione in questa fase I di coltura, le cellule non adese saranno raccolte, lavate, e rimesse in coltura in terreno fresco contenente eritropoietina umana ricombinante (EPO) 1 U/ml. Questa fase della coltura è denominata fase II (Fibach e al., 2003; Gambari e Fibach, 2007). Gli oligonucleotidi e le molecole di PNA saranno aggiunte al 4-5 giorno della fase II. I campioni cellulari saranno analizzati al 12° o 13° giorno della fase II. Noi abbiamo già dimostrato che queste cellule esprimono i microRNA 155, 221 and 222. Noi abbiamo già allestito le condizioni di PCR per determinare l’accumulo di queste sequenze. Gli effetti saranno studiati mediante un’analisi del profilo di espressione genica usando una piattaforma Eppendorf, tramite RT-PCR e analisi HPLC(questa sezione del progetto sarà realizzata dalla Dott.ssa Nicoletta Bianchi, Dott.ssa Monica Borgatti e Dott.ssa Cristina Zuccato).

(b) microRNA coinvolti nel cancro come bersaglio (oncomiRs).

E’ stato riportato che i microRNA giocano un ruolo cruciale nell’inizio e progresso del tumore umano (oncomiRs) (Cho, 2007). La disregolazione dell’espressione di oncomiRs è associata con alterazioni genetiche e epigenetiche, incluse delezioni, amplificazioni, siti di mutazione e metilazioni di DNA aberranti (questa sezione del progetto sarà attuata dalla Dott.ssa Monica Borgatti).

b1. OncomiRs sotto-espressi. L’espressione dei miR-15a e miR-16-1 è inversamente correlata all’espressione di Bcl2 in CLL e inoltre i miRNA possono essere dei regolatori negativi di Bcl2 a livello post-trascrizionale; in accordo col fatto che la repressione di Bcl2 ad opera di questi miRNA induce apoptosi in modelli cellulari leucemici. Perciò i miR-15a e miR-16-1 sono delle molecole naturali antisenso per Bcl2 che potrebbero essere usate per la terapia di una sovraespressione tumorale di Bcl-2. L’obiettivo di questa sezione del progetto sarà sviluppare molecole di PNA che mimano l’attività biologica di miR-15a e miR-16-1. Altri oncomiRs sotto-espressi sono miR-10b, miR-125b and miR-145 (tumore alla mammella) (questa sezione del progetto sarà eseguita dalla Dr.ssa Monica Borgatti e dalla Dott.ssa Irene Mancini).

b2. oncomiRs sovra-espressi. La sovra-espressione di microRNA è stata osservata in cellule tumorali. L’analisi che prevede l’impiego di micro-arrays che identificano tutti i miRNA conosciuti sono disponibili e ci permetteranno di identificare i possibili miRNA bersaglio. Tra questi microRNA sovra-espressi, noi prenderemo in esame i miR-17-5p e miR-20a, che vengono sovra-espressi nel tumore al polmone e i miR-21 and miR-155, sovra-espressi nel tumore alla mammella. In questa sezione del progetto, I PNA e i relativi analoghi saranno disegnati al fine di inibire l’attività degli oncomiR (questa parte del progetto sarà realizzata dalla Dr.ssa Monica Borgatti e dalla Dott.ssa Irene Mancini).

Task 2: RNA precursori come bersaglio.

(a) RNA precursori A-beta-H-J-J come bersaglio.

Lo splicing alternativo permette la produzione di differenti proteine da un singolo pre-mRNA, creando un elevato numero di proteine diverse derivate da un numero limitato di geni trascritti. Sebbene sia necessario per il normale sviluppo, lo splicing alternativo e le sue aberrazioni sono coinvolte anche in patologie come la talassemia, il cancro e malattie neurodegenerative. Le tecniche che permettono di alterare il processo di splicing possono presentare un elevato potenziale terapeutico. A tal proposito il locus A-beta-H-J-J J (Treves e al., 2000; Feriotto e al., 2006; Feriotto e al., 2007) è di notevole interesse dal momento che codifica per tre differenti proteine, aspartil-beta-idrolasi, giuntina e giuntate, e produce almeno 25 isoforme differenti di RNA mediante splicing alternativo. Noi proponiamo il disegno di specifiche molecole di PNA in grado di indurre uno selezionato processo di maturazione dell’RNA. L’analisi sarà attuata mediante RT-PCR e sequenziamento usando primers già disponibili nel nostro laboratorio e in grado di riconoscere tutte le isoforme di RNA del locus A-beta-H-J-J (questa sezione del progetto sarà realizzata dalla Dott.ssa Giordana Feriotto e dalla Dott.ssa Alessia Finotti).

(b) RNA per il gene beta-globinico mutato IVS-110 derivato da splicing aberrante come possibile bersaglio.

Nel caso della beta-talessemia, l’mRNA beta-globinico umano corretto è stato integrato in cellule eritroidi isolate da topo transgenico recante il gene umano per la beta-globina con la mutazione di splicing IVS2-654 e da pazienti talassemici con il genotipo IVS2-654/beta(E). Questo è stato realizzato in maniera tempo e dose dipendente tramite un libero uptake cellulare di oligonucleotidi morfolinici antisenso per il sito di splicing aberrante in posizione 652 dell’introne 2 nel pre-mRNA beta-globinico. In condizioni ottimali di uptake cellulare degli oligonucleotidi, i livelli massimi di mRNA beta-globinico corretto e di emoglobina A in cellule eritroidi isolate da pazienti sono stati 77 e 54% rispettivamente. L'efficacia dell’impiego di oligonucleotidi antisenso morfolinici liberi nel ripristinare il corretto splicing del pre-mRNA IVS2-654 in colture di cellule eritropoietiche potrebbe essere efficientemente riprodotto utilizzando PNA, dal momento che queste molecole sono in grado di ibridizzare ad alti livelli con mRNA bersaglio senza attivare RNasiH. Noi applicheremo i PNA antisenso che hanno come bersaglio la mutazione per la talassemia IVS - I - 110 al fine di inibire questo splicing aberrante. Questo potrebbe essere di grande interesse per il trattamento di pazienti con doppio beta° -39/beta-IVSI-110 (Gambari e Fibach, 2007). Noi useremo sia sistemi in vitro (cellule trasfettate con plasmidi di espressione che guidano la trascrizione di beta mRNA IVSI - 110 aberranti), nonché in sistemi in vivo (un topo transgenico che presenta i geni umani beta IVSI - 110). Questa fase del progetto si basa sul fatto che la degradazione degli RNA ottenuti mediante splicing aberranti aumenterà la traduzione degli RNA ottenuti attraverso un processo di splicing corretto, permettendo così la creazione di un fenotipo “più normale” (questa fase del progetto sarà attuata dalla Dott.ssa Francesca Salvatori, dalla Dott.ssa Nicoletta Bianchi e dalla Dott.ssa Cristina Zuccato).

Task 3: mRNA maturi come bersaglio di PNA che mimano l’attività siRNA. L’approccio anti-mRNA creato sarà applicato in nuovi sistemi al fine di ottenere rilevanti risultati sia dal punto di vista teorico che pratico.

(a) mRNA Runx-2 come bersaglio per alterare l’espressione del gene per il recettore umano dell’estrogeno.

Questa fase del progetto si basa sulla recente scoperta che siRNA contro Runx-2 mostrano un’interessante capacità di incrementare la trascrizione del gene umano per il recettore alfa dell’estrogeno (Lambertini et al., 2007). Noi valuteremo, gli effetti di una riduzione di Runx2 mediante una strategia siRNA sull’espressione e sulla funzione del recettore per gli estrogeni di tipo alfa (ERalfa). La riduzione di Runx2 in cellule SaOS-2 incrementa i bassi livelli endogeni di ERalfa, sia a livello di mRNA che di proteine, analizzati mediante RT-PCR quantitativa e Western Blot, rispettivamente. Il trattamento con Runx2-siRNA agisce rimuovendo il controllo negativo di Runx2 sul promotore F permettendo così un incremento della trascrizione del gene ERalfa. Per l’analisi quantitativa RT-PCR, le cellule SaOS-2 saranno seminate in piastre da 6 pozzetti. RNA totale sarà estratto usando il Total RNA Isolation System (Promega). Due microgrammi di RNA totale sarà retro-trascritto con ImProm-II RT System (Promega). Gli mRNA dei geni bersaglio saranno quantificati mediante Real-Time PCR usando lo strumento ABI Prism7700 e le sonde TaqMan 5’- TGA TGA AAG GTG GGA TAC GAA AAG A-3’ per ERalfa e 5’-ATC ATT GCC AGG TTT TCG AAA CTT A-3' per il recettore del progesterone (PR) (Applied 240Biosystems). I livelli di mRNA dei geni bersaglio saranno normalizzati rispetto ai livelli di mRNA GAPDH (gene di riferimento) e rispetto ai livelli di mRNA del controllo negativo (cellule non trattate).
Per l’analisi di Western blotting, le cellule saranno lavate due volte con PBS freddo e saranno preparati i lisati cellulari. Venticinque microgrammi di ogni campione sarà sottoposto a migrazione elettroforetica su gel al 12% SDS-poliacrilammide. Le proteine saranno poi trasferite su una membrana Immobilon-P PVDF che sarà incubata con gli anticorpi policlonali anti-Runx2 (1:1000), anti-ERalfa (1:500), e anti-IP(3) K (1:3000). Gli immunocomplessi saranno rilevati usando il sistema Super Signal West Fempto Substrate (Pierce). Anti-IP(3)K sarà utilizzata per verificare un caricamento proteico omogeneo.
Per l’analisi di gel retardation, le proteine nucleari saranno pre-incubate per 5 minuti a temperatura ambiente con competitore aspecifico DNA poly (dI–dC)–(dI–dC) e poi 10,000 cpm di oligonucleotidi marcati saranno aggiunti e incubati per ulteriori 30 minuti a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di supershift, gli estratti nucleari saranno pre-incubati per 15 minuti a temperatura ambiente con un anticorpo contro Runx2 prima di incubarli con gli oligonucleotidi marcati per 30 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni saranno sottoposte a elettroforesi e autoradiografia (questa sezione del progetto sarà realizzata dalla Dott.ssa Letizia Penolazzi).

(b) mRNA anti-apoptotici come bersaglio.

La terapia farmacologia basata sull’induzione di apoptosi è di notevole rilevanza per differenti patologie. Per esempio, noi abbiamo dimostrato che l’impiego di molecole decoy contro fattori di trascrizione anti-apoptotici permette un efficiente induzione di apoptosi in osteoclasti umani sia in vitro che in vivo. L’induzione di apoptosi in osteoclasti (OCs) è importante per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nell’osteoporosi, artrite reumatoide e metastasi ossea.
Disegneremo delle molecole di PNA contro l’mRNA anti-apoptotico Bcl-xL. Bcl-x è un membro della famiglia di geni Bcl-2 che a seguito di splicing alternativo genera due principali isoforme Bcl-xS e Bcl-xL, quest’ultima con attività anti-apoptotica. Perciò l’induzione di una sovra-espressione di Bcl-2S o un decremento dei livelli di Bcl-xL rendono le cellule sensibili a differenti agenti anti-neoplastici. Gli OCs umani saranno preparati come riportato da Matsuzaki et al. con qualche modifica. In breve, il sangue periferico sarà ottenuto dopo consenso informato da donatori sani. Le cellule mononucleari (PBMC) saranno preparate da sangue periferico diluito, che verrà stratificato su una soluzione Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, USA), centrifugato (400g) recuperato e risospeso in D-MEM/10% FCS. PBMC saranno seminate in piastra da 24 pozzeti o in chamber slides per due ore; i pozzetti saranno poi lavati per rimuovere le cellule non-adese. I monociti saranno mantenuti in coltura a 37° C, 5 % CO2 in terreno addizionato con FCS al 10% e coltivati per 14 giorni in presenza di M-CSF, RANKL e PHT umani (Penolazzi e al., 2003; Piva e al., 2005). Il terreno di coltura sarà sostituito con terreno fresco ogni 3-4 giorni. Le cellule saranno usate per gli esperimenti descritti quando quelle multi-nucleate saranno predominanti nelle colture. Gli OCs saranno individuati mediante test colorimetrico con fosfatasi acida tartrato resistente (TRAP) e analisi immunocitochimica. Dopo 14 giorni di coltura e 2-4 giorni di trattamento, le cellule saranno lavate due volte con PBS e fissate con paraformaldeide al 4% per 25 minuti a temperatura ambiente. Le cellule apoptotiche saranno rilevate mediante saggio DeadEnd Colorimetric Apoptosis Detection System (Promega) in base al protocollo della ditta produttrice. La misura del grado di apoptosi sarà calcolato come percentuale di nuclei apoptotici (nuclei di color marrone-nero) rispetto al totale dei nuclei di cellule multinucleate positive al TRAP in tre esperimenti indipendenti (Penolazzi e al., 2003; Piva e al., 2006) (questa sezione del progetto sarà realizzata dalla Dott.ssa Letizia Penolazzi).

Task 4: Analisi di sonde PNA per la rilevazione di RNA virale nei protocolli diagnostici (in collaborazione con la RU Marchelli).

Questa fase del progetto si occuperà di virus coinvolti nella contaminazione alimentare (per esempio i norovirus) conosciuti come importanti agenti eziologici per epidemie di gastroenteriti acute. Le strategie saranno attuate al fine di valutare la presenza di microrganismi vivi rispetto ai morti nei campioni di cibo analizzati mediante sequenze di RNA bersaglio (piuttosto che di DNA) che permangono dopo la morte del patogeno. L’RU Gambari impiegherà i PNA sviluppati dalla RU Marchelli (Parma) usando lo strumento BIAcore (Feriotto e al., 2001; Corradini e al., 2004) e lo strumento Bio-plex (Penolazzi e al., 2007). I risultati saranno comparati con quelli ottenuti dalla RU Spoto (Catania).