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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano
Bibliografia
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Programma di ricerca

Malattie allergiche e immunologiche negli atleti
Università di riferimento
Università degli Studi di TORINO - SCIENZE BIOMEDICHE ED ONCOLOGIA UMANA - ()
Responsabile dell'Unità di ricerca
Caterina Bucca
Descrizione
Obiettivo primario
Studiare la relazione tra lo stato nutrizionale, valutato attraverso i livelli plasmatici di diversi fattori nutritizi, in particolare la vitamina D, il calcio ed il selenio, e la presenza di sintomi scatenati dall’esercizio fisico e la disfunzione delle vie aeree, soprattutto il broncospasmo indotto da esercizio fisico (EIB) e il restringimento delle alte vie aeree (EA-HR). EIB e EA-HR saranno valutate attraverso il test di iperventilazione volontaria eucapnica (EVH) e ipocapnica (HVH) in giovani atleti.
Obiettivo secondario
Studiare la relazione tra la vitamina D, il calcio e i livelli plasmatici di selenio , e il numero di linfociti T regolatori (Treg) (CD4+, CD25high, FOXp3+).
Studiare la relazione tra la presenza di EIB e/o EA-HR ed il numero di linfociti T regolatori circolanti (CD4+, CD25high, FOXp3+).
Studiare l’effetto della vitamina D e del Selenio sull’attivazione e sulla proliferazione delle cellule T regolatorie (CD4+, CD25high, FOXp3+) attraverso il dosaggio delle citochine nei supernatanti di colture cellulari a partire dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
Pazienti
Giovani atleti (con un’età compresa tra 14 e 18 anni) associati a società di calcio locali, saranno invitati a partecipare allo studio. Almeno 100 soggetti saranno arruolati. I soggetti non i dovranno essere in terapia con steroidi nasali o inalatori o con steroidi sistemici ed antistaminici da almeno 15 giorni prima della valutazione funzionale-infiammatoria. Il consenso informato sarà ottenuto in base alla dichiarazione di Helsinki.
1) Questionario
Un questionario sui sintomi respiratori delle alte e basse vie aeree sarà somministrato a tutti i soggetti in accordo al questionario ISAAC (Pearce N, Worldwide trends in the prevalence of asthma symptoms: phase III of the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC).Thorax. 2007 Sep;62(9):758-66.). Un questionario sulla nutrizione sarà anche riportato (una versione modificata del questionario EPIC)
2) Valutazione dello stato nutrizionale
Campioni di sangue saranno ottenuti attraverso prelievo venoso in tutti i soggetti allo scopo di quantificare i livelli plasmatici di vitamina D, paratormone, calcio, fosforo, magnesio e selenio.Le concentrazioni di vitamina D saranno determinate attraverso un kit commerciale immunoenzimatico in base alle istruzioni della ditta produttrice. I livelli sierici di selenio saranno misurati mediante spettrometria atomica ad assorbimento. Saranno anche determinati i livelli sierici di comuni nutrienti (vitamina B12, acido folico, vitamina C, ferro).
3) Diagnosi di broncospasmo indotto da esercizio fisico (EIB), asma indotta da esercizio fisico (EIA) e iperresponsività delle vie aeree extratoraciche indotta da esercizio fisico (EA-HR).
Tutti i soggetti effettueranno una valutazione spirometria basale con curva flusso-volume , usando uno pirometro computerizzato BAIRES (BIOMEDIN, Padova, Italia).
Si effettuerà il test all’iperventilazione volontaria eucapnica (EVH) in base alla seguente procedura: ogni soggetto iperventilerà per sei minuti (30 x del volume espiratorio forzato in 1 secondi (FEV1) ), respirando una mistura di gas contenente CO2 %%, O2 21% e N2 74%. La curva flusso-volume sotto sforzo massimale sarà misurata prima del test e 3, 5, 10 e 15 minuti dopo aver interrotto il test. Ad ogni intervallo di tempo saranno misurati il FEV1, il flusso massimo espiratorio a 50% della capacità vitale (MEF50%), la capacità vitale forzata (FVC), il flusso massimo inspiratorio a 50% della capacità vitale (MIF50%), Il test sarà considerato positivo per EIB se si verifica una caduta del FEV1 superiore al 10% dai valori basali. (14). Il test sarà considerato positivo per iperresponsività delle vie aeree extratoraciche (EA-HR), cioè per VCD indotta da esercizio, se si verificherà una caduta del MIF50% maggiore del 25% dai valori basali (16). Il test di iperventilazione volontaria ipocapnica (HVH) (Dejaegher P, Hypocapnic hyperventilation versus isocapnic hyperventilation with ambient air or with dry air in asthmatics. Eur J Respir Dis. 1987 Feb;70(2):102-9) sarà effettuato come segue: respirazione massimale (iperventilazione) sarà ottenuta per un minuto in un boccaglio connesso ad un capnografo (BIOMEDIN, Padova, Italia). Durante il HVH, la end-tidal CO2 nell’aria respirata (PEtCO2) diminuisce fino al 70% del valore basale (sotto 30 torr). La FEV1 e la curva flusso-volume massimale saranno registrati immediatamente dopo l’iperventilazione e dopo 3 minuti di riposo. Gli stessi parametri (FEV1, MIF50) usati per l’EVH saranno utilizzati per esprimere l’EIB e la VCD (Bucca C, ATS 2003 proceedings). (Lindeman KS. Hypocapnia-induced contraction of porcine airway smooth muscle. Eur Respir J. 1998 Nov;12(5):1046-52.). In presenza di EIB e di sintomi respiratori (sibilo, dispnea, oppressione toracica, tosse) scatenati dall’esercizio fisico sarà formulata una diagnosi di asma indotta da esercizio fisico (EIA) (Weiler JM. Exercise-induced asthma: a practical guide to definitions, diagnosis, prevalence, and treatment. Allergy Asthma Proc. 1996 Nov-Dec;17(6):315-25). In presenza di EA.HR e sintomi di stridore e dispnea sarà formulata una diagnosi di VCD.
Alla fine dello studio tutti soggetti saranno raggruppati in base al tipo di iperresponsività all’esercizio fisico: non responders, EIB, EIA, EIVCD. Sara quindi valutata l’associazione tra la disfunzione delle vie aeree e livelli dei nutrienti presi in considerazione.
4)Misurazione dell’ossido nitrico nell’aria esalata FENO)
La misurazione verrà effettuata in accordo alle raccomandazioni dell’ ATS (ATS, Am J Respir Crit Care Med 1999). Il FENO è misurato attraverso un analizzatore a chemiluminescenza (Sievers NOA 280, Sievers, Boulder, CO, USA ) usando un campionamento ad un flusso di 50 ml/min. La determinazione dei valori di FENO viene calcolata quando si raggiunge un plateau di fine espirazione (flusso 45mL/s) che duri almeno 3 secondi. I pazienti effettueranno almeno 3 prove accettabili ed il valore medio verrà registrato. Sarà misurao anche il valore di ossido nitrico nasale.
5) Analisi statistica
Le variabili saranno analizzate attraverso una statistica descrittiva. Le caratteristiche associate ad una diversa iperresponsività all’esercizio saranno confrontate attraverso l’analisi della varianza o il test di Mann.Whitney, in base alla distribuzione delle variabili. LE variabili categoriali saranno confrontate con il test esatto di Fisher. I dati saranno analizzati attraverso il software statistico SPSS (SPSS versione 13.0 per Window; SPSS; Chicago, IL). Tutti i valori p saranno a 2 code e solo valori < 0.05 saranno considerati significativi.
6) Valutazione della sottopopolazione dei linfociti T regolatory
Al fine di valutare i Treg circolanti, i monociti dal sangue periferico (PBMC) saranno isolati da sangue periferico eparinizzato attraverso gradiente a densità di centrifugazione usando la tecnicadel Ficoll-Hypaque. L’analisi dei marcatori di superfici cellulari sarà effettuata usando la citofluorimetriaa flusso a 3 o 4 colori. Saranno usati anticorpi monoclinali marcati con fluorocromi rivolti verso CD4, CD25, CD8, CD56 insieme con gli appropriati controlli isotipici per permettere l’identificazione delle popolazioni cellulari positivi e negativi. Sarà effettuato lo staining intracellulare per FOXP3 usando un kit disponibile commercialmente , in base alle istruzioni della ditta produttrice. La frequenza dei linfociti T reg periferici e i livelli plasmatici di vitamina D e selenio saranno determinati prima e dopo challenge all’iperventilazione e correlati con i risultati clinici del challenge.
7) Effetti in vitro della Vitamina D e del Selenio sulle sottopopolazioni di linfociti T regolatori circolanti
Al fine di valutare gli effetti modulatori della vitamina D e del selenio esogeno sui Treg, i PBMC da giovani atleti con EIA o asintomatici saranno esposti alla vitamina D (1,25(OH)2D3 e al sodio selenite una comune forma di selenio nella dieta) a differenti concentrazioni in assenza o in presenza di biglie coniugate con anti CD3/CD28 per la stimolazione. Dopo 5 giorni di coltura sarà quantificata la produzione nei supernatanti delle colture cellulari di TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, e IL-10 attraverso Kit in ELISA. Le cellule saranno raccolte e analizzate per i marcatori di Treg attraverso citofluorimetria come precedentemente descritto.
8) Risultati attesi
Ci si aspetta di trovare i seguenti risultati nei giovani atleti arruolati nello studio:
- una frequenza di broncospasmo indotto da iperventilazione volontaria, di asma e di VCD comparabile e quella riportata in letteratura con test da sforzo tradizionali
- una correlazione tra la responsività al test di VH e lo stato nutrizionale: in particolare una correlazione tra i livelli di calcio e vitamina D e la risposta laringea all’HV: ci si aspetta che soggetti con bassi livelli abbiano uno spasmo laringeo più grave e prolungato durante l’iperventilazione , in particolare durante il test in condizioni ipocapniche.
- Ci si aspetta un’associazione tra i livelli di vitamina D e selenio ed il numero e lo stato di attivazione delle cellule Treg , in particolare ci si aspetta una diminuzione delle T reg e della loro attivazione negli stati di deficit. Ciò dovrebbe correlare alla propensione allo sviluppo di EIB o VCD. L’aggiunta in vitro ai Treg di selenio e vitamina D potrebbe modulare la produzione da parte delle Treg stesse di IL-10 e TGF-beta.