RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Malattie allergiche e immunologiche negli atleti

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata" - MEDICINA INTERNA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Costanzo Moretti

Descrizione

13 - Descrizione del programma e dei compiti dell’Unità di Ricerca

Gli studi “in vitro” saranno sviluppati utilizzando una linea cellulare di mioblasti di topo la C2C12


Modello in vitro verrà sviluppato con lo scopo di :

1. Analizzare in linee di cellule muscolari l'espressione di neuropeptidi e di marcatori dell'induzione e del differenziamento miogenico a seguito di trattamento con testosterone, al fine di chiarire come gli androgeni possano influenzare a livello molecolare il differenziamento muscolare.
2. Verificare l'espressione e/o la modulazione di IGF-I (e sue isoforme muscolari), VEGF, PACAP ed IL-6 a seguito di trattamento con testosterone di cellule muscolari, con lo scopo di chiarire se le vie di segnale attivate da questi peptidi possano essere un target di modulazione attraverso il quale il testosterone eserciti i suoi effetti miogenici.
3. Studiare le pathways di trasduzione del segnale coinvolte nella regolazione del differenziamento miogenico e dell'angiogenesi muscolare testosterone-indotta, al fine di capire come l'androgeno possa agire sul processo di rigenerazione muscolare.


Modello in vivo
Successivamente all'analisi in vitro dell'attivazione genica androgeno-indotta nel muscolo scheletrico, si potrà passare ad un'analisi in vivo.

1. Stabilire in soggetti maschi di età superiore ad anni 50 le potenziali correlazioni esistenti tra somministrazione di testosterone ed espressione nel muscolo del recettore androgenico e del VEGF, IGF-I, PACAP ed IL-6 al fine di capire se anche in vivo esiste una correlazione tra il Testosterone e questi neuropeptidi importante ai fini della rigenerazione muscolare.
2. Valutare su campioni ottenuti da agoaspirato muscolare la espressione muscolare di geni coinvolti nel metabolismo degli androgeni, al fine di analizzare su larga scala il pathway di trasduzione del segnale alla base dell'attività degli androgeni sul tessuto muscolare del maschio.

PROCEDURA SPERIMENTALE
Il modello cellulare scelto per l'analisi in vitro è la linea cellulare C2C12 derivata da cellule satelliti murine.

1. Coltura delle cellule. Le C2C12 hanno la caratteristica di mimare in vitro gli step fondamentali dell'induzione miogenica sia dal punto di vista molecolare che morfologico. Cresciute in un terreno di crescita (GM, DMEM supplementato con siero di feto bovino al 10%) esse si mantengono nello stato proliferativo di mioblasti. Se da questa condizione vengono passate in un terreno differenziativo (DM, DMEM supplementato con siero di cavallo 2%) esse differenziano in miociti. Dopo qualche giorno di crescita in DM, è possibile osservare anche la formazione di miotubi.
2. Analisi del differenziamento cellulare. L'avvenuto differenziamento delle C2C12 descritto al punto uno può essere monitorato a livello molecolare. Verrà analizzata l'espressione nei mioblasti, nei miociti e nei miotubi, a livello di RNA messaggero e/o a livello di proteina, dei seguenti fattori:
- MyoD (marcatore di mioblasti);
- Miogenina (marcatore di miociti e miotubi);
- Catena pesante della miosina (MHC) (marcatore di miociti e miotubi);
- p21 (inibitore del ciclo cellulare e la cui comparsa quindi indica un processo di differenziamento in atto);
- ciclina D1 (la cui inibizione correla con l'uscita dal ciclo cellulare e l'inizio del differenziamento).
Verranno estratti l'RNA totale e le proteine totali di C2C12 cresciute in GM e in DM per 24 e 72 ore. Tramite analisi per Northern Blot e/o RT-PCR su RNA totale e Western Blot su proteine totali verrà analizzata la variazione dell'espressione dei marcatori sopra citati per verificare l'effettivo differenziamento cellulare. Parallelamente verrà anche eseguita l'analisi morfologica delle cellule in coltura analizzando la formazione di miotubi.
3. Effetto del testosterone sul differenziamento muscolare. A cellule C2C12 in GM e in DM verrà aggiunto nel mezzo di coltura testosterone a diverse concentrazioni (0,1, 1, 10, 100 nM). A tempi diversi, verranno estratti l'RNA e le proteine totali e analizzata la possibile modulazione di espressione dei marcatori descritti al punto 2 a seguito di trattamento con testosterone. In tale modo sarà possibile capire se il testosterone agisce sulla dinamica temporale del processo di differenziamento del muscolo.
4. Effetto del testosterone sull'espressione di VEGF, IGF-I, PACAP ed IL-6 e dei rispettivi recettori. A cellule C2C12 in GM e in DM verrà aggiunto nel mezzo di coltura testosterone a diverse concentrazioni (0,1, 1, 10, 100 nM). Di tali cellule verrà raccolto il sovranatante su cui attraverso saggio ELISA verrà analizzata la quantità di VEGF secreto. Inoltre verranno estratti RNA e proteine totali per analizzare l'espressione dei recettori del fattore di crescita.
5. Studio del possibile ruolo di VEGF, IGF-I, PACAP ed IL-6 nell'ipertrofia muscolare androgeno-indotta. Le cellule verranno trattate con testosterone in presenza di inibitori dei possibili pathways di trasduzione del segnale a monte dell'induzione di VEGF (p. es. induzione di HIF-1?), e verrà analizzato l'effetto di tali inibitori sui marcatori di differenziamento cellulare testosterone indotti. L'analisi verrà effettuata come descritto al punto 2. Per esempio, è possibile analizzare in prima istanza se il testosterone eserciti i suoi effetti in quanto tale o a seguito della sua trasformazione in diidrotestosterone (DHT) a seguito della sua riduzione da parte dell'enzima 5-?-reduttasi. Per analizzare questo le cellule verranno trattate con T in presenza di inibitori specifici della 5-?-reduttasi.
6. Analisi in vivo. Stabilire in soggetti maschi e femmine di età superiore ad anni 50, classificati clinicamente attraverso esame DXA (composizione corporea e peso del tessuto grasso) i rapporti tra forza muscolare, riserva cardiovascolare e livelli di steroidi plasmatici (androgeni ed estrogeni), per definire nuovi criteri di caratterizzazione del fenotipo endocrino in relazione allo sforzo muscolare nel corso dell’età. A tale scopo è necessaria la ricerca di soggetti adulti nelle differenti decadi della vita, di sesso maschile e femminile, idonei ad essere inclusi dopo firma del consenso informato nei quali può essere monitorata la funzione cardiorespiratoria attraverso la misura del massimo consumo di ossigeno (VO2max) durante prove da sforzo. In questi soggetti dovrà essere eseguita una valutazione della composizione corporea attraverso DXA. I soggetti dovranno essere disponibili ad eseguire (prima e dopo il trattamento) una biopsia muscolare del vasto laterale idonea ad ottenere tessuto muscolare per la misura di RNA messaggero e proteine.
7. Dal tessuto bioptico verranno estratti RNA totale e/ o proteine totali sui quali analizzare l'induzione del recettore degli androgeni, PACAP, IL-6, IGF-I e VEGF al fine di correlare questi parametri con il recupero di massa e forza muscolare.