RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Malattie allergiche e immunologiche negli atleti

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "Foro Italico" - SCIENZE DEL MOVIMENTO UMANO E DELLO SPORT - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Daniela Caporossi

Descrizione

Lo scopo principale della nostra ricerca si propone di analizzare in linfociti e fibroblasti sclerali umani, e in modelli murini di cellule di muscolo scheletrico e cardiaco, la correlazione tra esposizione in vitro a NGF, VEGF, GH/IGF1, correlati con la risposta del sistema neuro- immunoendocrino, e:
a) modulazione della risposta allo stress, proliferazione cellulare e della suscettibilità all’induzione all’apoptosi. Lo studio prevede l’analisi dell’induzione di danno ossidativo al DNA, espressione di proteine da stress (Hsp70, Hsp27, HIF1a), modulazione dell’attività di NFkB e AKT, e dell’espressione dei geni coinvolti nel controllo della proliferazione cellulare (c-myc, ciclina E) e dell’apoptosi (Bcl-2 e Bcl XL).
b) ruolo di recettori specifici (i.e., VEGFR1 and VEGFR2, GHR, TrkA and p75) nella modulazione della proliferazione cellulare e dell’apoptosi indotta da differenti condizioni di stress (stress ossidativi e ipossico)..

FASI DEL PROGETTO
I 12 mesi del programma saranno dedicati al campionamento e alla raccolta dei dati secondo il seguente flusso:

1° FASE (6 mesi)
Applicazione dei protocolli sperimentali precedentemente descritti sui campioni linfocitari di 10 soggetti sani volontari:
Studio della risposta cellulare dose-dipendente all'esposizione di cellule muscolari e fibroblasti sclerali a dosi crescenti di fattori di crescita, con analisi della proliferazione cellulare, induzione di apoptosi e di danno genotossico

Risultati intermedi:
La prima fase del progetto consentirà di affrontare delineare i seguenti aspetti:
1. Esistenza di un effetto dose-dipendente e/o di una sinergia tra le due sostanze quando usate in combinazione.
2. Valutazione della modulazione della proliferazione, sopravvivenza e apoptosi cellulare da parte di fattori di crescita neuroimmunoendocrini.
3. Valutazione della suscettibilità al danno da agenti genotossici e/o pro-apoptotici in presenza di fattori di crescita neuroimmunoendocrini.

2° FASE (6 mesi)
Verifica della modulazione da parte di fattori di crescita neuroimmunoendocrini dell'attività di NFkB e AKT, e dell'espressione dei geni coinvolti nel controllo della proliferazione cellulare (c-myc, ciclina E) e dell'apoptosi (Bcl-2 e Bcl XL) in linfociti e fibroblasti sclerali. Verifica del ruolo di NGF, VEGF, GH/IGF1 e dei loro nella modulazione della proliferazione cellulare e dell'apoptosi possibilmente modulata dai fattori di crescita.

Risultati ottenibili senza Cofinanziamento MIUR
Sarà possibile effettuare esclusivamente la prima fase del programma relativa al primo campione di linfociti da sangue venoso periferico.

MATERIALI E METODI
L'analisi sui linfociti periferici sarà effettuata da campioni di sangue venoso periferico ottenuti come segue:

CAMPIONE
Il campione sarà costitutito come segue:
N 10 soggetti sani, 5 femmine e 5 maschi, sani, 18-25 anni.

2. Protocollo Convocazioni
2.1 Consenso informato.
2.2 Anamnesi: Questionario stile di vita (alcol, attività fisica abituale) - Questionario medico (patologie attuali e pregresse, uso corrente di farmaci, recenti indagini radiografiche, ecc.).
2.4 Attività fisica abituale. L'attività fisica abituale sarà misurata mediante il test 'Baecke Questionnaire. (24) che fornisce un punteggio aperto (da 0 in su), calcolato sulla base di codici di frequenza e intensità di attività comuni, sport e tempo libero.
2.5 Esame obiettivo.
2.6 Prelievo di sangue venoso periferico:
.- 5 ml in EDTA.
.- 20 ml in eparina per lo studio del danno nucleare.
- Prelievo per RIA GH and testosterone

PARAMETRI ENDOCRINI
GH: Il dosaggio del GH plasmatico verrà eseguito mediante RIA
Testosterone: Il dosaggio del testosterone verrà eseguito mediante RIA

COLTURE CELLULARI
Purificazione e coltura dei linfociti dal sangue periferico - I linfociti purificati dal sangue periferico (1x106/250µL) verranno risospesi in RPMI-1640 contenente: Fetal Calf Serum (FCS, 10% v/v) inattivato al calore, penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 U/mL), glutamina (2 mM) (Euroclone, Milano, Italia) e usati per i differenti esperimenti.
Colture primarie di fibroblasti sclerali -. Le biopsie sclerali (da cadaveri, Banca degli occhi di Roma, Italia) verranno poste in piastre da 24 pozzetti per una settimana, al fine di ottenere fibroblasti della sclera (FBs). Le cellule ottenute dalle biopsie saranno espanse in T21/75cm2 flasks (4 passaggi) in DMEM contenente 10% FCS inattivato al calore, 2mM g/mL streptomicina, at 37°C, 5% CO2µglutamina, 100U/mL penicillina, 100 (Euroclone, Milano, Italyia). La purezza dei fibroblasti verrà assegnata in accordo con le procedure standard.

Colture a lungo termine di mioblasti scheletrici (C2C12, topo, L6C5, ratto) indifferenziati (D-MEM High glucose, FBS 10%, pen-strepto) o miotubi differenziati in coltura tramite bassa concentrazione di siero (D-MEM High glucose, FBS 2%, pen-strepto). Colture di cardiomiociti HL-1 (Claycomb medium + FBS 15%, pen-strepto, glutamina)

VALUTAZIONE DEL DANNO OSSIDATIVO AL DNA

8OHdG - I livelli di 8-OHdG NEL dna saranno valutati mediante metodo immunologico (8-OHdG ELISA kit, JAICA, Japan).

PROLIFERAZIONE CELLULARE
Gli effetti dei fattori di crescita sulla proliferazione cellulare saranno investigati mediante conta diretta delle cellule dopo trattamento enzimatico (trypan blue exclusion test). Come indice di valutazione indipendente, sarà valutato anche l'espressione del ki67 su cellule prefissate mediante l'uso di un anticorpo policlonale (rabbit anti-human ki67 antibody, 1:1000, Santa Cruz), secondo la tecnica dell'ABC. Il Ki67 è un fattore di proliferazione nucleare espresso dalle cellule in tutte le fasi del ciclo cellulare eccetto G0. Inoltre, verrà effettuato il test dell'incorporazione della timidina triziata ([3H]-thymidine uptake) secondo una procedura standardizzata.

CITOTOSSICITA'
La sopravvivenza cellulare sarà misurata tramite rilevazione della frazione di cellule metabolicamente attive utilizzando un saggio MTS (CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega), o mediante Trypan blue exclusion test.
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APOPTOSI
a) frammentazione nucleare in mioblasti e cardiomiociti fissati e colorati con Hoechst. Le cellule muscolari, differenziate e non, saranno cresciute direttamente in coltura aderenti ad un vetrino coprioggetto, lavate con PBS, fissate con paraformaldeide 4%.
b) "DNA ladder" in gel di agarosio gel electrophoresis, Le cellule trattate con GH saranno processate nel seguente modo: DNA ladder o DNA fragmentation per mezzo di elettroforesi in gel di agarosio. La frazione intracellulare solubile di DNA sarà estratta da cellule trattate e non, stimolate con GH, ed estratte mediante il Puregene DNA purification kit (Gentra Systems). Quantità equivalenti di DNA (2µg) saranno separate per elettroforesi in gel di agarosio al 2%, marcate con bromuro di etidio ed analizzate al Kodak 550 Imager station.
c) in situ labeling of apoptosis-induced DNA strand breaks (TUNEL) Marcatura i situ delle cellule apoptotiche (TUNEL). I frammenti di DNA saranno marcati mediante l'utilizzo della Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), la quale catalizza la formazione di poliAAA 3' terminali in presenza di biotina dUTP. L'incorporazione di nucleotide biotinilati sarà visualizzata mediante marcatura secondo la tecnica dell'ABC in fluorescenza. FBs in via di apoptosi saranno identificati mediante TdT-mediated dUTP nick e labeling (TUNEL). Brevemente, le cellule saranno fissate (30min in PFA), pre-trattate con proteinasi K (10µg/mL per 15min, Finnzyme), ed infine incubate con una mistura contenente Biotin-16-dUTP (1093-070, Boehringer Manneheim) e TdT (8008SB, Gibco/BRL) in TdT buffer. Dopo 1hr di incubazione, la reazione sarà sviluppata secondo la tecnica dell'ABC in fluorescenza (vedi sopra). Per questi esperimenti, controlli positive (trattamenti con DMSO) e negativi (trattamenti con 10%FBS) saranno allestiti in parallelo.
d) attivazione di caspasi su estratto proteico totale (caspasi-3, caspasi-8, caspasi-9; Caspase Assay Colorimetric Kit o Antibody, Promega, Sigma

NFkB e AKT Attività di NFkBp65 nei linfociti purificati - Il livello di NFkB p65 sarà misurato tramite un kit colorimetrico contenente anticorpi specifici contro la forma attiva di NFkB p65 legata al DNA, il TransAM NFkB p65 (Active Motif), la cui sensibilità risulta maggiore rispetto al classico metodo EMSA.

EMSA per NF-kB - L'estratto nucleare sarà preparato e quantificato secondo procedure standard. Il saggio sarà effettuato come precedentemente descritto (Catani et al., 2004). In breve, l'estratto nucleare (5-10ug) sarà incubato in tampone di binding specifico contenente come probe marcato l'oligonucleotide consenso per il sito di legame di NF-kB. marcati Il pattern di legame sarà identificato come specifico per NF-kB tramite l'utilizzo di probe non marcato e anticorpi-supershifts. Dopo elettroforesi in gel di acrilamide non-denaturante, il gel verrà disidratato e visualizzato tramite autoradiografia.

Akt Phosphorylation Assay - Per la valutazione dei livelli di fosforilazione di AKT, estratto cellulare totale sarà utilizzato come descritto nel PhophoPlus Akt (Ser473) antibody kit (New England BioLabs, Beverly, MA).

IMMUNOBLOTTING
Le cellule (1-3x106) saranno lavate in PBS e poste in buffer di lisi contenente dithiothreitolo. La quantificazione proteica sarà effettuata tramite metodo Bradford. I campioni proteici (10-50 ug) saranno separati in gel SDS-PAGE e le proteine trasferite su membrana di cellulosa. Le membrane saranno incubate over-night a 4°C in TBS-T. Le proteine saranno identificate tramite anticorpi specifici in TBS-T con 2% BSA. Dopo ripetuti lavaggi, verrà utilizzato l'appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidi. Dopo lavaggi, le bande proteiche saranno messe in evidenza attraverso un sistema chemioluminescente.

SILENZIAMENTO GENICO SPECIFICO PER TrkA e/o p75
(Small Interference RNA, siRNA)- Sequenze specifiche di siRNA saranno utilizzate al fine di silenziare trkA e/o p75 nei FBs. Tali sequenze (prive di sali, duplex, 20nM/tube, 25mer duplex RNAi oligonucleotidi) saranno disegnate secondo la tecnica "Stealth. RNAi" messa a punto dalla Invitrogen (website https://rnaidesigner.invitrogen.com):
hu-trkANGFR S 5'-CCAUCGUGAAGAGUGGUCUCCGUUU-3';
hu-trkANGFR AS 5' AAACGGAGACCACUCUUCACGAUGG-3';
hu-p75NTR S 5'-CCGUUUGCUGUGAACCCUAUGUUAU-3';
hu-p75NTR AS 5'-AUAACAUAGGGUUCACAGCAAACGG-3'.
I duplex di siRNA saranno riscostituiti alla concentrazione di 20µM in acqua e conservati a -20°C, secondo una procedura standard.
Il silenziamento sarà effettuato mediante un elettroporatore (Amaxa GmbH, Instrumentation Laboratory, Milan, Italy), e con kit disponibili dalla casa (02VCO1001 o 502VPI1002 Nucleofector kits, Amaxa). La procedura di elettroporazxione sarà ottimizzata secondo le necessità: 1x106 single-cells saranno risospese in 100µL Nucleofactor buffer (in assenza di siero), 6µL o 9µL of GFP o dei duplex siRNA specifici od in loro assenza (control interno), in particolari cuvette (Amaxa), rapidamente elettroporati (program), raccolti in 1mL di medium pre-riscaldato e distribuiti in piastre da 6 pozzetti o flask T21cm2. Dopo 18, 24 and 48hrs dal piastramento, le cellule saranno esaminate per stabilire la % di efficienza della trasfezione e/o il grado di silenziamento genico (80-90%), mediante PCR specifica per trkA o p75. Al fine di confermare il silenziamento anche a livello proteico, le cellule saranno marcate con anticorpi anti-trkA o anti-p75 specifici, secondo la tecnica dell'immunofluorescenza, e valuatate al confocale o analizzate al FACSCalibur, mediante il programma CELLQuestPro (BD).

ESPRESSIONE DELL'mRNA DI trkA E p75.
L'RNA totale verrà estratto da cellule mediante il kit di estrazione Puregene (GENTRA, Celbio, Milano, Italia). La qualità dell'RNA estratto verrà poi valutato attraverso corsa elettroforetica delle bande ribosomiali 28S e 18S su gel di Agarosio, acquisito con un Kodak imager station (Kodak 550, Eastman Kodak Company, Sci. Imaging Systems, Rochester, NY) e attraverso il rapporto di assorbanza allo spettofotometro (tra 260 e 280 nm). 3 µL cDNA ottenuti mediante retrotrascrizione saranno utilizzati per l'amplificazione genica di NGF, trkA e p75 con la Real-time PCR. La soluzione per la Real-time PCR è costituita da 3 µL di cDNA e 17 µL di master mix contenente 10µL di mix(SYBR Green PCR Master Mix; Applied Biosystems, Foster City, CA), 0.5 µL of ogni primer (10 pM) e 6µL di acqua DEPC. Il programma sarà quindi settato a 95°C per 15 minuti, di seguito, inizieranno i 44 cicli di denaturazione a 94°C per 30 secondi, annealing 55-65°C per 30 secondi (dipende dal primer) e di estensione a 75°C per 30 secondi, completata da un'ulteriore etensione a 75°C per 5 minuti (Opticon2 MJ termociclatore, MJ Research). I campioni saranno inoltre amplificati con i primer HIS3/GAPDH per la determinazione relativa dell'ammontare di ciascun cDNA, al fine di normalizzare tutti i prodotti di PCR. I controlli negativi saranno quelli privi di templato o RNA totale. Tutti i campioni ed i relativi controlli verranno amplificati in triplicato e quantificati.

IMMUNOBLOTTING PER TrkA E p75
Le proteine saranno estratte dalla cellule mediante l'utilizzo di una soluzione di lisi (30min a 4°C, 50mM Tris, 150mM NaCL, 1% Nonidet P40, 1mM EDTA, 10µg/mL Aprotinina e 1mM PMSF, pH 7.5). Il contenuto proteico sarà valutato mediante test medificato di Bradford (Bio-Rad Laboratories). Quantità equivalenti di proteine/campione (30 µg) saranno diluite in loading buffer per 5min, separate in gel 7-12% SDS-PAGE (160V/3hrs in apparato Miniprotean3, Bio-Rad) e trasferite su membrana Hy-bond (Amersham Pharmacia Biotech, Rome, Italy) in condizioni di semi-dry (15V/1hour, semi-dry blotting apparatus, Bio-Rad). Le membrane saranno successivamente marcate con anticorpi specifici per trkA o p75 diluiti in 10mM PBS-0.05% Tween-20 per 24hours at 4°C. Dopo lavaggio, anticorpi specie-specifici coniugati alla perossidasi saranno aggiunti per 2 hours (1/7000 in TBS-TW, Jackson ImmunoResearch). La marcatura specifica sarà valutata mediante la tecnica dell'ECL kit (SuperSignal West Pico Trial, Pierce) e le bande saranno acquisite al Kodak Image station (Kodak). Le immagini saranno digitalizzate, quantificate e processate mediante Adobe Photoshop 7.0 (Abacus Concepts. Incs., San Jose, CA, USA). In alcuni casi, le membrane saranno disattivate e riutilizzate per marcare il GAPDH (Abcam, Cambridge, UK).

ANALISI DEI DATI
Per l'analisi statistica verrà utilizzato il software SPSS o StatView II (Abacus, Concepts. Inc. USA). Dopo le analisi di base, a seconda della natura dei dati sarà applicato il t-test di Student e l'ANOVA, o Mann-Whitney e lo Spearman correlation test in caso di non normalità. Il coefficiente di correlazione e la regressione multipla saranno invece utilizzati per valutare le relazioni tra le differenti variabili.