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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
Bibliografia
In questa lista sono incluse anche le referenze citate nella descrizione del programma

1) Allan A. C. and Fluhr R. (1997). Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells. Plant Cell, 9: 1559-1572.
2) Angelini R. et al. (1993) Involvement of polyamines, diamine oxidase and peroxidase in resistance of chickpea to Ascochyta rabiei. J. Plant Physiol., 142: 704-709
3) Angelini R. et al. (2007) Polyamine oxidase involvement in wound healing. Plant Physiology, in stampa.
4) Bagni N., Tassoni A. (2001) Biosynthesis, oxidation and conjugation of aliphatic polyamines in higher plants. Amino Acids, 20:301-317.
5) Binda C. et al. (1999) A 30 A long U-shaped catalytic tunnel in the crystal structure of polyamine oxidase. Structure, 7: 265-276.
6) Boucherau A. et al. (1999) Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci. 140: 103-125.
7) Chinchilla D. et al. (2007) A flagellin-induced complex of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defence. Nature, 448(7152):497-500
8) Coghlan, S.E. (1990) Polyamine metabolism in 'green-islands' on powdery mildew-infected barley leaves: possible interactions with senescence. New Phytol., 116: 417-424.
9) Cohen S.S. (1998) A guide to the polyamines. Oxford University Press. New York-Oxford.
10) Cona A. et al. (2003) Polyamine oxidase, a H2O2-generating enzyme, is up-regulated by light and down-regulated by auxin in the outer tissues of the maize mesocotyl. Plant Physiol., 131: 803-813.
11) Cona A. et al. (2006) Amine oxidases: role in development and defense. Trends in Plant Science, 11(2):80-8
12) Cona A. et al. (2006) Flavin-containing polyamine oxidase is a hydrogen peroxide source in the oxidative response to the protein phosphatase inhibitor cantharidin in Zea mays L. J Exp Bot. 57:2277-89.
13) Cowley T., Walters D.R. (2002) Polyamine metabolism in barley reacting hypersensitively to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f.sp. hordei. Plant Cell Environ., 25: 461-468.
14) Forrester MT et al (2007) Assessment and application of the biotin switch technique for examining protein S-nitrosylation under conditions of pharmacologically induced oxidative stress. J Biol Chem. 282:13977-83.
15) Huang B and Chen C (2006) An ascorbate-dependent artifact that interferes with the interpretation of the biotin switch assay Free Radical Biology & Medicine 41: 562–567
16) Karimi, M. et al. (2002) GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant Transformation. Trends in Plant Science 7, 193-195.
17) Kershaw M.J. (2005) Four conserved intramolecular disulphide linkages are required for secretion and cell wall localization of a hydrophobin during fungal morphogenesis. Mol Microbiol. 56 (1) : 117-25.
18) Kumar V. et al. (1996) Crystal structure of a eukaryotic (pea seedling) copper-containing amine oxidase at 2.2 A resolution. Structure, 4: 943-55.
19) Marini F. et al. (2001) Polyamine metabolism is upregulated in response to tobacco mosaic virus in hypersensitive, but not in susceptible tobacco. New Phytol., 149:301-309.
20) Miller et al. (2007) Molecular imaging of hydrogen peroxide produced for cell signalling. Nature Chemical Biology 3: 263-267
21) Moller SG, McPherson MJ (1998) Developmental expression and biochemical analysis of the Arabidopsis atao1 gene encoding an H2O2-generating diamine oxidase. Plant J., 13:781-91.
22) Møller S.G. et al. (1998) Nematode-induced expression of atao1, a gene encoding an extracellular diamine oxidase associated with developing vascular tissue Physiol. Mol. Plant Pathol. 53:73-79
23) Polticelli et al. 2005 Lys300 plays a major role in the catalytic mechanism of maize polyamine oxidase. <br />Biochemistry. 44: 16108-20.
24) Rea G. et al. (2002) Copper amine oxidase expression in defense responses to wounding and Ascochyta rabiei invasion. Plant Physiol., 128: 865-875.
25) Rea G. et al. (2004) Ectopic expression of maize polyamine oxidase and pea copper amine oxidase in the cell wall of tobacco plants. Plant Physiology 134: 1414-1426.
26) Sebela M. et al. (2002) FAD-containing polyamine oxidases: a timely challenge for researchers in biochemistry and physiology of plants. Plant Sci., 160: 197-207.
27) Tavladoraki P. et al. (1998) Maize polyamine oxidase: primary structure from protein and cDNA sequencing. FEBS Lett., 426: 62-66.
28) Tavladoraki et al. (2006) Heterologous expression and biochemical characterization of a polyamine oxidase from Arabidopsis involved in polyamine back conversion. Plant Physiol., 141: 1519-32.
29) Walters D.R.( 2003) Polyamines and plant disease. Phytochemistry, 64: 97-107.
30) Yoda H. et al. (2003) Induction of hypersensitive cell death by hydrogen peroxide produced through polyamine degradation in tobacco plants. Plant Physiol. 132: 1973-1981.
31) Yoda et al. (2006) Polyamine oxidase is one of the key elements for oxidative burst to induce programmed cell death in tobacco cultured cells. Plant Physiology 142: 193–206.

Programma di ricerca

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE
Università di riferimento
Università degli Studi ROMA TRE - BIOLOGIA - ()
Responsabile dell'Unità di ricerca
Riccardo Angelini
Descrizione
Questo progetto ha come obiettivo principale la comprensione del ruolo delle ammino ossidasi nella formazione e differenziamento del compartimento apoplastico durante lo sviluppo e nei meccanismi di difesa delle piante nei confronti degli stress ambientali. Le conoscenze sul metabolismo delle poliammine nell’apoplasto, sul ruolo specifico dei diversi membri delle famiglie geniche codificanti ammino ossidasi extra-citoplasmatiche e sulle loro relazioni funzionali con altre importanti proteine apoplastiche studiate nel progetto integrato sono tuttora insufficienti. E' indispensabile quindi ampliare l’orizzonte delle conoscenze attualmente disponibili applicando strategie e metodiche innovative anche nell’ottica di un efficace trasferimento di queste conoscenze di base al miglioramento delle capacità di resistenza a stress in specie di interesse agronomico. Questi studi, effettuati in piante modello quali tabacco, arabidopsis e mais, forniranno preziosi contributi alle conoscenze di base necessarie al miglioramento delle caratteristiche di resistenza ai patogeni ed agli stress abiotici delle specie vegetali di interesse agronomico.

OBIETTIVI SPECIFICI DEL PROGETTO:
1) Studiare le caratteristiche biochimiche, le modalità di espressione e chiarire il ruolo fisiologico di due CuAO apoplastiche di Arabidopsis thaliana mediante espressione eterologa, analisi del pattern di espressione durante lo sviluppo e le risposte di difesa e la caratterizzazione di mutanti inserzionali.
2) Determinare le caratteristiche biochimiche ed il ruolo fisiologico di PAO di Arabidopsis con localizzazione apoplastica, anche mediante caratterizzazione di mutanti inserzionali.
3) Studiare il ruolo di queste proteine nella regolazione dello stato redox dell’apoplasto durante lo sviluppo e nelle risposte di difesa indagando le loro relazioni funzionali con LRR-RLK, BAK1, RbohD e Air12
4) Determinare possibili modificazioni post-traduzionali della ZmPAO e studiarne il ruolo nella regolazione delle proprietà catalitiche, stabilità e secrezione della proteina nel contesto della formazione dell’apoplasto e nelle risposte di difesa.

1. AMMINO OSSIDASI A RAME APOPLASTICHE IN ARABIDOPSIS: ESPRESSIONE ETEROLOGA, CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E STUDI SUL LORO RUOLO NEI PROCESSI APOPLASTICI ASSOCIATI ALLO SVILUPPO ED ALLE RISPOSTE DI DIFESA
4 dei 10 geni CuAO rinvenuti in A. thaliana codificano per proteine indirizzate nella via secretoria che potrebbero avere un ruolo nella formazione del milieu apoplastico sia durante il differenziamento della parete cellulare sia nelle risposte di difesa. Di questi, AtCuAO1 (At4g14940) e AtCuAO2 (At1g62810) sono di grande interesse in relazione al presente progetto in quanto la loro espressione viene indotta, rispettivamente, durante lo sviluppo del tessuto xilematico (21) o in seguito ad infezione da Botrytis cinerea.

1.1 CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E PROFILO DI ESPRESSIONE DI AtCuAO1 e AtCuAO2

PRIMO ANNO
I cDNA codificanti per le due AtCuAO1 e AtCuAO2 con localizazione predetta extracellulare saranno ottenuti da banche di cDNA e/o mediante RT-PCR. I due cDNA saranno sequenziati interamente per confermare la corretta sequenza e saranno inseriti in un vettore per l'espressione eterologa in Pichia pastoris, Escherichia coli o in Nicotiana benthamiana. In quest’ultimo caso, si utilizzerà il sistema transiente che prevede l'uso di un vettore basato sul genoma del virus X della patata. Le proteine ricombinanti, purificate dal sistema eterologo che conferisce maggiori livelli di espressione, saranno caratterizzate per le loro proprietà catalitiche e successivamente saranno fornite all'UR III per la cristallizzazione e determinazione della struttura tridimensionale.

SECONDO ANNO
Sarà effettuato un studio sulle modalità di espressione di AtCuAO1 e AtCuAO2 durante lo sviluppo, le risposte della pianta ad infezioni fungine (B. cinerea) e ferite come anche in seguito a trattamenti delle piante con un panel di ormoni vegetali, mediante Real Time RT-PCR in collaborazione con l'UR II. I risultati di questa analisi saranno messi in relazione al contenuto di poliammine libere e legate e alla produzione di perossido di idrogeno nell’apoplasto. L’accumulo di perossido di idrogeno sarà valutato mediante microscopia confocale utilizzando sonde fluorescenti non permeanti (Amplex Ultra Red) e nuove sonde fluorescenti ad alta sensibilità (Peroxy green) specifiche per il perossido di idrogeno mai provate finora nei tessuti vegetali (20). Nelle indagini istochimiche sarà utilizzata la 2-bromoetilammina come inibitore suicida specifico delle CuAO per verificare il contributo di quest’ultime alla produzione di perossido di idrogeno. Saranno effettuate anche analisi morfologiche (spessore pareti cellulari), istochimiche (rilevazione di lignina, suberina, fenoli) secondo protocolli già messi a punto dall’UR proponente (3, 24).

1.2 CARATTERIZZAZIONE DI MUTANTI INSERZIONALI DI ARABIDOPSIS PER AtCuAO1 E AtCuAO2

PRIMO ANNO
Per un'analisi approfondita sul ruolo fisiologico di AtCuAO1 e AtCuAO2, si caratterizzeranno mutanti inserzionali di Arabidopsis per questi geni, già disponibili nelle banche di semi di Arabidopsis. In particolare, questi mutanti, dopo avere eliminato gli eventuali T-DNA presenti in loci non correlati ai geni della AtCuAO in esame e verificato la diminuzione dei livelli di espressione, saranno esaminati per il contenuto delle poliammine libere e legate come anche per il loro fenotipo in condizioni di crescita normali. Questi mutanti saranno caratterizzati anche in relazione alla produzione di perossido di idrogeno nell’apoplasto, ed alle caratteristiche della parete cellulare come riportato in 1.1.

SECONDO ANNO
I mutanti inserzionali di AtCuAO1 ed AtCuAO2 saranno analizzati in seguito a trattamento con un panel di ormoni vegetali ed elicitori (inclusi gli OG) come anche in condizioni di stress, quali infezione con B. cinerea o Pseudomonas syringae, in collaborazione con l’UR II, e ferimento. Anche in questo caso sarà determinata la produzione di perossido di idrogeno nell’apoplasto, e verranno effettuate le analisi istochimiche e morfologiche come riportato in 1.1.

2. AtPAO: LOCALIZZAZIONE, ESPRESSIONE GENICA E CARATTERIZZAZIONE DI MUTANTI INSERZIONALI
Per quanto riguarda le AtPAO, abbiamo scelto di focalizzare l’attenzione su AtPAO1, che in analogia a NtPAO potrebbe avere una una localizzazione extracitoplasmatica, ed AtPAO5 di cui non è nota una specifica localizzazione.

PRIMO ANNO
2.1 Studi di localizzazione subcellulare delle AtPAO1 e AtPAO5
Al fine di ottenere più solide acquisizioni sulla localizzazione subcellulare delle AtPAO oggetto di studio, saranno preparati costrutti, basati sui plasmidi pK7FWG2 e pK7WGF2 (16) codificanti proteine di fusione PAO-GFP in cui il tag fluorescente è posto all’N- o al C termine della proteina. Questi costrutti saranno espressi transientemente mediante agroinfiltrazione in foglie di A. thaliana e Nicotiana tabacum. Saranno quindi condotte, in collaborazione con l’UR V, analisi di localizzazione subcellulare mediante microscopia confocale delle cellule transientemente trasformate.

2.2 Caratterizzazione biochimica di AtPAO5 e purificazione di AtPAO1 per la determinazione della struttura tridimensionale
Sulla base dell’esperienza sull’espressione di AtPAO1 in E. coli (28), sarà effettuata l’espressione di AtPAO5 in sistemi eterologhi e la caratterizzazione biochimica come descritto in 1.1. AtPAO1 sarà purificata secondo protocolli già disponibili e fornita all’UR III per la cristallizzazione e la risoluzione della struttura tridimensionale.

2.3 Caratterizzazione di mutanti inserzionali di Arabidopsis per AtPAO1 e AtPAO5
Mutanti inserzionali di Arabidopsis per AtPAO1 e AtPAO5 saranno ottenuti dalle banche di semi e caratterizzati. In particolare, questi mutanti, dopo avere eliminato gli eventuali T-DNA presenti in loci non correlati e verificato la diminuzione dei livelli di espressione, saranno esaminati per il contenuto delle poliammine libere e legate, come anche per il loro fenotipo in condizioni di crescita normali. Questi mutanti saranno caratterizzati istochimicamente per la produzione di perossido di idrogeno, la lignificazione e le caratteristiche morfologiche come riportato in 1.1.

SECONDO ANNO
2.4 Mutanti inserzionali di Arabidopsis per le AtPAO1 e AtPAO5: risposta a stress biotici ed abiotici.
I mutanti di cui al punto 2.3 saranno analizzati in condizioni di stress, quali infezioni con B. cinerea o P. syringae in collaborazione con l’UR II, e ferite. La produzione di perossido di idrogeno nell’apoplasto, le analisi istochimiche e morfologiche saranno realizzate come riportato in 1.1.

2.5 AtPAO1 e AtPAO5: espressione genica ed analisi del promotore
Saranno condotti studi di espressione genica mediante Real Time RT-PCR. Sarà effettuata anche un’analisi del promotore attraverso la trasformazione di piante di Arabidopsis con costrutti prom:GFP-GUS. Questi studi saranno condotti durante lo sviluppo dei differenti organi e nel contesto di vari stress biotici (in collaborazione con l’UR II) ed abiotici (come descritto in 2.4).

3. STUDI SULLE RELAZIONI FUNZIONALI TRA AMMINO OSSIDASI, LRR-RLK, BAK1, RbohD E Air12

SECONDO ANNO
Nell’ottica di indagare possibili relazioni funzionali tra CuAO, PAO e le altre proteine apoplastiche studiate nel progetto integrato nel contesto della regolazione dello stato redox dell’apoplasto e nella difesa, saranno caratterizzati mutanti rbohD, Air12, BAK1 ed altri LRR-RLK messi a disposizione dalle UR II e IV. I recettori della famiglia LRR-RLK sono coinvolti nella percezione e nella trasduzione del segnale degli oligogalatturonidi e della flagellina batterica, le proteine BAK1 fanno parte di sistemi multicomponenti (BAK1-BRI1, FLS2-BAK1) che trasducono il segnale proveniente dai brassinosteroidi e dalla flagellina batterica, le proteine RbohD hanno un ruolo importante nella produzione delle ROS nell’apoplasto e le Air12 contribuiscono all’omeostasi redox di questo compartimento. Questi mutanti saranno sottoposti a trattamenti con elicitori od ormoni, o infezioni e la produzione di perossido di idrogeno sarà determinata come descritto in 1.2 in presenza di inibitori specifici di CuAO (2-bromoetilammina) e PAO (prenilagmatina). Incroci saranno realizzati tra i mutanti AtCuAO e AtPAO e rbohD per verificare il contributo di questi sistemi alla produzione di perossido di idrogeno. Incroci saranno realizzati anche tra i mutanti AtCuAO e AtPAO con i mutanti BAK1, o altri LRR-RLK, per verificare se la produzione di perossido di idrogeno derivante dalle specifiche ammino ossidasi durante lo sviluppo o in seguito a stress è sotto il controllo di vie di segnalazione diverse da quelle mediate da questi recettori (7).

4. MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DELLA POLIAMMINO OSSIDASI DI Zea Mays: IMPLICAZIONI NELLA REGOLAZIONE E SECREZIONE

E’ noto come l’espressione della ZmPAO apoplastica sia fortemente modulata durante la crescita, il de-eziolamento (10) ed in seguito all’induzione del “burst” ossidativo da parte di inibitori di fosfatasi (cantaridina) (12) come anche nel corso di infezioni e ferite (3, 29, 31). Uno degli obiettivi del presente progetto è lo studio dell’esistenza di eventuali modificazioni post-traduzionali della ZmPAO associate agli eventi di crescita e differenziamento nei processi di sviluppo e difesa.

4.1 FOSFORILAZIONE
PRIMO ANNO
4.1.1 Studi teorici ed analisi mediante spettrometria di massa
In collaborazione con l’UR III, sarà eseguita un’indagine teorica attraverso l’analisi della struttura tridimensionale della ZmPAO, mirata all’identificazione delle Ser, Thr e Tyr che tra quelle potenzialmente fosforilabili risultano essere collocate sulla superficie esterna della proteina divenendo pertanto facilmente accessibili all’azione di eventuali chinasi o fosfatasi. Successivamente sarà eseguita (in collaborazione con l’UR II) un’analisi di spettrometria di massa della ZmPAO purificata in presenza o assenza di inibitori di fosfatasi per determinare eventuali residui fosforilati.

SECONDO ANNO
4.1.2 ZmPAO: Identificazione di forme fosforilate in vivo
Per rilevare in vivo la presenza di eventuali isoforme fosforilate della ZmPAO si procederà ad analizzare la proteina estratta da differenti tessuti della plantula di mais tramite western blot utilizzando specifici anticorpi anti-Ser, -Thr e -Tyr fosforilate. In particolare la ZmPAO, estratta in presenza e assenza di inibitori di fosfatasi, sarà purificata attraverso procedure di immunopurificazione, che consentiranno di isolare contemporaneamente la ZmPAO da più campioni. Negli stessi estratti saranno valutate le costanti catalitiche della proteina. Questi studi saranno effettuati durante il de-eziolamento e nel corso di stress quali ferite ed infezione con patogeni (in collaborazione con l' UR II).

4.2 ZmPAO: NITROSILAZIONE, FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO, GLICOSILAZIONE
La presenza di due cisteine esposte al solvente nella regione carbossi-terminale della ZmPAO (5) potrebbe rappresentare un ulteriore possibilità di regolazione della proteina in quanto siti potenziali di S-nitrosilazione. Inoltre, questi amminoacidi potrebbero essere coinvolti nella formazione di ponti disolfuro intra- o intermolecolari che potrebbero avere importanti implicazioni sia in relazione alla regolazione dei livelli di attività enzimatica della ZmPAO o alla sua secrezione (17). Nel contesto del presente progetto è inoltre di grande interesse comprendere se la glicosilazione (5) della proteina ha un ruolo nella secrezione della stessa nell’apoplasto.

PRIMO ANNO
4.2.1 S-nitrosilazione in vitro della ZmPAO
Al fine di indagare sulla possibile suscettibilità alla S-nitrosilazione della ZmPAO, la proteina pura sarà incubata con donatori di NO (quali nitroprussiato o SNAP) secondo protocolli già descritti in letteratura (15), e la presenza di eventuali siti S-nitrosilati verrà analizzata tramite il metodo “biotin switch” (14), operando gli opportuni controlli (15). La ZmPAO verrà purificata successivamente al trattamento con gli agenti nitrosilanti e sottoposta ad analisi delle costanti catalitiche.

4.2.2 ZmPAO: mutagenesi sito specifica della Cys463
Per studiare gli effetti sulle costanti catalitiche della ZmPAO della presenza o meno di un ponte disolfuro tra Cys457 e Cys463, sarà caratterizzato il mutante sito-specifico della ZmPAO Cys463Ser espresso in Pichia pastoris (23).

SECONDO ANNO
4.2.3 Determinazione in vivo di isoforme s-nitrosilate della ZmPAO La presenza in vivo di eventuali isoforme S-nitrosilate della ZmPAO sarà analizzata mediante il metodo “biotin switch” (vedi 4.2.1) dopo immunoprecipitazione di omogenati di mais, analogamente a quanto descritto per le isoforme fosforilate (4.1.2). Questi studi saranno effettuati durante lo sviluppo e nel corso di stress quali ferite ed infezione con patogeni (in collaborazione con l' UR II).

4.2.4 Ruolo della glicosilazione e delle cys457/463 nella secrezione della ZmPAO nell’apoplasto: analisi confocale dei mutanti di fusione con GFP
Per determinare il possibile ruolo nel trasporto nell’apoplasto della ZmPAO dalle due cisteine carbossiterminali verrà ottenuto da parte dell’UR proponente anche il mutante Cys457Ser (vedi punto 4.2.2). Questo mutante, come anche il mutante Cys463Ser e il doppio mutante, verranno messi in fusione con GFP. Saranno quindi condotte analisi mediante microscopia confocale delle cellule di A. thaliana e/o N. tabacum trasformate con i costrutti codificanti i suddetti mutanti, come descritto in 2.1, per determinare la distribuzione sub-cellulare della fluorescenza in collaborazione con l’UR V. Analoga strategia sarà applicata per verificare il possibile ruolo della presenza di glicani sull’Asn105 nel processo di secrezione della proteina. In particolare sarà studiata, in collaborazione con l’UR V, la secrezione del mutante Asn105Ser espresso in fusione con GFP come sopra descritto.