RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE

Università di riferimento

Università degli Studi "G. d'Annunzio" CHIETI-PESCARA - SCIENZE BIOMEDICHE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luca Federici

Descrizione

Il nostro gruppo è stato ed è molto attivo nell’applicare approcci di biologia strutturale e bioinformatica alla caratterizzazione di proteine apoplastiche e dei loro target sia fisiologici che patogenici. Questo progetto è l’ideale continuazione dei nostri sforzi nel chiarire le basi strutturali del riconoscimento pianta-patogeno mediato da proteine LRR con la caratterizzazione di due eventi correlati e cruciali nel riconoscimento di patogeni di origine sia fungina che batterica. Allo stesso tempo, proponiamo anche di cominciare a studiare due eventi attivati dalla percezione sia degli OG che della flagellina, ovvero la produzione di H2O2 per mezzo dell’ossidazione di poliammine e la regolazione dell’omeostasi redox dell’apoplasto ottenuta attraverso l’overespressione di Air12 indotta da OG e flagellina.
Il progetto è basato sulla attiva collaborazione con la UR II, per quanto riguarda la caratterizzazione delle interazioni PG-PGIP e FLS2-flg22, con la UR I per la caratterizzazione strutturale delle PAO e CuAO apoplastiche e con la UR IV per la caratterizzazione strutturale di Air12.
Il laboratorio è ben equipaggiato per la biologia molecolare, l’espressione, la purificazione e l’analisi funzionale e strutturale per mezzo di metodologie spettroscopiche (dicroismo circolare, spettrofluorimetro, spettroscopia di assorbimento) e di spettrometria di massa (MALDI-TOF e Q-TOF). Inoltre, sono a disposizione di questo progetto le più moderne attrezzature per la cristallizzazione di proteine e l’acquisizione dei dati di diffrazione, incluso un robot per la cristallizzazione in nanogocce che ci permette di testare migliaia di condizioni di cristallizzazione consumando la minor quantità possibile di proteina purificata.

Obiettivi specifici
1) Identificazione e validazione dei siti PGIP per il riconoscimento delle PG: un approccio razionale all’evoluzione guidata dal target
2) Un approccio chimerico alla determinazione della struttura del complesso PG-PGIP
3) Caratterizzazione strutturale del dominio extracitoplasmatico di FLS2 e la sua interazione con flg22
4) Analisi strutturale degli enzimi che ossidano le poliammine nell’apoplasto di Arabidopsis
5) Caratterizzazione strutturale di Air12


Task 1: Identificazione e validazione dei siti PGIP per il riconoscimento delle PG: un approccio razionale all’evoluzione guidata dal target

Risultati preliminari
Questo task si basa su risultati da noi ottenuti in passato in collaborazione con UR II. In un primo approccio ci siamo chiesti se le differenze aminoacidiche nel lato concavo del dominio LRR delle prime due isoforme PGIP di fagiolo, potessero condizionare la capacità e la specificità di riconoscimento di PG prodotte da funghi diversi. Abbiamo scoperto che ciò non solo è vero ma anche, che l’effetto di una singola mutazione cambia a seconda della PG presa in esame. Questo risultato è in accordo con la nostra analisi delle cinetiche di inibizione che mostra come la stessa isoforma PGIP inibisce PG diverse con diversi meccanismi. In un secondo approccio del tutto indipendente, abbiamo calcolato l’energia di desolvatazione sulla superficie di PGIP2 di fagiolo, utilizzando l’algoritmo Optimal docking Area (ODA). Questo approccio ha identificato la superficie concava del dominio LRR come quella interessata al riconoscimento ed ha selezionato diversi residui specifici. Alcuni di questi sono anche variabili nelle diverse isoforme di fagiolo.

Anno 1
In collaborazione con UR II verificheremo l’ipotesi che i geni PGIP siano sottoposti a selezione positiva. Per far questo selezioneremo una serie di sequenze geniche PGIP appartenenti a diverse famiglie, ad esempio fabaceae, brassicaceae e rosaceae. L’analisi sarà volta alla identificazione dei rapporti delle frequenze di sostituzione non sinonima e sinonima e della loro rilevanza statistica. Ciò permetterà di predire le posizioni aminoacidiche sottoposte a selezione purificatrice, neutrale oppure a selezione positiva a causa di una pressione selettiva esercitata dal patogeno. L’analisi verrà eseguita usando il software PAML. I residui selezionati verranno confrontati con quelli già determinati usando il metodo ODA. Una selezione di residui identificati dai due metodi, e che possibilmente soddisfino entrambi i requisiti, sarà sottoposta a mutagenesi. A questo scopo un sistema di espressione di PGIP2 in Pichia pastoris è stato già approntato.

Anno 1 e Anno 2
L’UR II ha già messo a punto l’espressione eterologa di una serie di PG fungine, fra cui quelle di Fusarium monilifome, Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Colletotrichum lupini e Stenocarpella maydis. In collaborazione con UR II, purificheremo queste proteine in quantità sufficienti per i saggi di inibizione. L’attività inibitoria dei diversi mutanti verrà testata contro il pool completo di PG per mezzo di saggi di diffusione in agar. I mutanti più interessanti, ovvero quelli che mostreranno differenze rispetto alla proteina nativa, verranno anche caratterizzati con metodi colorimetrici.

Risultati attesi
Dato che abbiamo già dimostrato che la PGIP2 di fagiolo è capace di inibire PG diverse con meccanismi di inibizione diversi (sia competitivo che non competitivo), probabilmente a causa del riconoscimento di superfici diverse, ci aspettiamo di ottenere una “impronta digitale” per ciascuna PG. Intendiamo con “impronta digitale” il set di residui necessario al riconoscimento di una specifica PG. L’analisi di come queste impronte digitali coincidano o differiscano potrà essere utilizzata per mettere a punto mutazioni in grado di estendere lo spettro di inibizione di PGIP2, che potranno essere testate contro PG attualmente non riconusciute come quella di Fusarium moniliforme ceppo PD e quella di Colletotrichum gloeosporioides.


Task 2: Un approccio chimerico alla determinazione della struttura del complesso PG-PGIP

Risultati preliminari
Negli anni passati abbiamo determinato la struttura della PGIP2 di fagiolo e di due PG fungine che sono riconosciute da PGIP2 con diversi meccanismi di inibizione. Purtroppo ogni tentativo di cristallizzare il complesso PG-PGIP è fino ad ora fallito. In verità, abbiamo ottenuto diversi cristalli ma questi, una volta risolta la struttura, rivelavano la presenza di uno solo dei partner dell’interazione, probabilmente a causa una perdita di affinità del complesso nelle condizioni estreme delle soluzioni di cristallizzazione. Per superare questo problema, in collaborazione con UR II, abbiamo preparato un costrutto che contiene le regioni codificanti dei geni PG di Fusarium moniliforme e PGIP2 di fagiolo fuse e separate da una regione flessibile costituita dalla ripetizioni di sette moduli di tipo Gly4Ser. La lunghezzza del linker è stata decisa in base alle nostre simulazioni di docking e le predizioni di struttura secondaria indicano che il linker è flessibile. Analisi preliminari indicano che la chimera così concepita viene espressa in Pichia pastoris in quantità ragionevoli.

Anno 1
Verrà messo a punto un protocollo di purificazione della chimera dal terreno di cultura di Pichia pastoris. La chimera verrà caratterizzata dal punto di vista dell’integrità strutturale e dell’attività con una combinazione di tecniche spettroscopiche. Verranno ottenuti diversi milligrammi di chimera pura che verranno utilizzati per uno screen completo delle condizioni di cristallizzazione per mezzo del robot. Se si ottengono cristalli questi saranno testati per la diffrazione ed eventualmente i dati saranno raccolti con luce di sincrotrone. Il nostro gruppo dispone di tempo macchina per il prossimo anno nei seguenti sincrotroni: ESRF (Grenoble) BeSSY (Berlino) ed ELETTRA (Trieste).

Anno2
Se si arriva a raccogliere i dati di diffrazione, la struttura verrà risolta con il metodo della sostituzione molecolare utilizzando le strutture delle proteine isolate che abbiamo già risolto. Un piano contingente, se il costrutto già preparato non dovesse portare a cristalli, è quello di sostituire la PG di Fusarium moniliforme, la PGIP2 di fagiolo o entrambe con altre PG o PGIP.

Risultati attesi
Ci aspettiamo di determinare la struttura del complesso PG-PGIP o, perlomeno, di aver ottenuto cristalli che diffrangano per la fine del progetto. Questo è un obiettivo molto ambizioso che, se perseguito, sarebbe di estrema importanza dato che, ad oggi, non è nota la struttura di nessun complesso relativo alla percezione pianta-patogeno.

Task 3: Caratterizzazione strutturale del dominio extracitoplasmatico di FLS2 e la sua interazione con flg22

Risultati preliminari
E’ stato già mostrato da altri gruppi che il dominio extracellulare LRR di FLS2 è cruciale per l’interazione con la flagellina. Dato che siamo principalmente interessati all’evoluzione delle capacità di riconoscimento mediate da domini LRR, incentreremo la nostra analisi solo su questo dominio di FLS2 (FLS2-LRR). Un costrutto per l’espressione del dominio isolato è stato già clonato in un vettore per l’espressione in pianta. L’espressione transiente in Nicotiana tabacum è stata verificata tramite analisi Western.

Anno 1
In collaborazione con l’UR II, tenteremo l’espressione costitutiva di FLS2-LRR in Nicotiana tabacum e/o Nicotiana benthamiana. Inoltre il costrutto FLS2-LRR verrà clonato in un vettore adatto all’espressione in Pichia pastoris. Il sistema di espressione che garantirà la produzione della maggior quantità di proteina verrà utilizzato per purificare FLS2-LRR in quantità utili all’analisi strutturale. Verrà ottimizzato un protocollo di purificazione, utilizzando la coda di sei istidine che si trova sul lato C-terminale del costrutto.

Anno 2
La proteina verrà utilizzata per uno screen completo delle condizioni di cristallizzazione sia da sola che in complesso con flg22. Parte della proteina purificata sarà inoltre utilizzata da UR II per caratterizzare l’interazione tramite risonanza plasmonica di superfice. Un approccio alternativo, dipendente dalla quantità di proteina che si riuscirà ad ottenere sarà il FRET con l’aiuto di flg22 opportunamente dansilato. Se si riuscirà ad ottenere cristalli, questi verranno ottimizzati e si raccoglieranno i dati di diffrazione. Questa struttura non potrà essere risolta per sostituzione molecolare, data l’assenza di un modello affidabile, per cui verrà utilizzato il metodo della sostituzione isomorfa multipla che è basato sull’analisi differenziale di cristalli nativi e trattati con metalli pesanti.

Risultati attesi
L’aspettativa minima è di ottimizzare un protocollo per l’espressione e la purificazione di FLS2-LRR in quantità che ne permettano la caratterizzazione funzionale e strutturale. Questo obiettivo è molto importante perchè attualmente non abbiamo a disposizione nessun dato biochimico o strutturale circa l’interazione FLS2-flg22, che costituisce il principale sistema modello per lo studio del riconoscimento di pattern associati ai batteri fitopatogeni. Naturalmente se riuscissimo ad ottenere cristalli nel corso del progetto, i nostri sforzi saranno concentrati sulla risoluzione della struttura.

Task 4: Analisi strutturale degli enzimi che ossidano le poliammine nell’apoplasto di Arabidopsis

Questo Task è basato sulla collaborazione fra la nostra UR e l’UR I. Le proteine oggetto di questo task saranno clonate, espresse e purificate dall’UR I e noi ci occuperemo dell’analisi cristallografica.

Anno 1
Il primo obiettivo di questo task è la caratterizzazione strutturale di AtPAO1. Un protocollo di espressione in E. coli e purificazione per AtPAO1 è stato già elaborato dall’UR I, che ci fornirà la proteina pura in quantità idonee all’analisi cristallografica. Il robot di cristallizzazione verrà utilizzato per testare la cristallizzazione di AtPAO1 sia da sola che in complesso con diversi inibitori, il cui legame ad AtPAO1 è stato già caratterizzato, come guazatina, N-prenilagmatina e 1,12-diaminododecano. Inoltre effettueremo esperimenti di co-cristallizzazione con il substrato naturale spermina, allo scopo di ottenere cristalli della forma ridotta della proteina. Se si otterranno cristalli la struttura potrà essere risolta per sostituzione molecolare utilizzando la struttura della PAO di mais come modello per l’analisi di Patterson. Parallelamente coadiuveremo l’UR I nell’analisi dei potenziali siti di fosforilazione della PAO di mais.

Anno 2
Durante il primo anno, uno dei compiti dell’UR I è di elaborare un protocollo di espressione e purificazione di AtCuAO1 ed AtCuAO2 in Pichia pastoris od altri sistemi. Se questo obiettivo dovesse essere raggiunto, l’UR I produrrà le due AtCuAO per la nostra analisi delle condizioni di cristallizzazione. Nel caso si ottengano cristalli, queste strutture potranno essere risolte per sostituzione molecolare utilizzando la CuAO di pisello come templato.

Risultati attesi
Ci aspettiamo di determinare la struttura di AtPAO1, possibilmente sia nello stato ossidato che ridotto ed anche in complesso con diversi inibitori. Questi studi ci permetteranno di comprendere le basi strutturali della specificità di substrato di questo enzima, che differisce da quella classica degli omologhi vegetali e ricorda invece le PAO di mammifero. Per quanto riguarda AtCuAO1 ed AtCuAO2, un primo passo cruciale sarà quello di verificare se queste proteine possono essere espresse in quantità adatte all’analisi cristallografica. Dato che entrambe queste proteine sono apoplastiche ma regolate differenzialmente da ormoni e patogeni, sarà di estremo interesse cercare di trovare una base funzionale e strutturale a questa diversa regolazione.

Task 5: Caratterizzazione strutturale di Air12

Questo task si basa sulla collaborazione tra la nostra UR e l’UR IV. Uno degli obiettivi di UR IV in questo programma è di sviluppare un sistema di espressione eterologa per Air12 di soia.

Anno 2
Il nostro coinvolgimento in questo task è condizionato dalla possibilità di esprimere la proteina in Pichia pastoris od in un altro sistema eterologo. Se ciò dovesse avvenire l’UR IV provvederà a purificare una quantità ragionevole di proteina per l’analisi delle condizioni di cristallizzazione al robot.

Risultati attesi
L’aspettativa minima è quella di verificare se Air12 può essere espressa in quantità pari a milligrammi di proteina pura. Se ciò dovesse verificarsi, ci aspettiamo di essere in grado di testare su Air12 tutte le diverse condizioni di cristallizzazione a nostra disposizione (oltre mille).