RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE

Università di riferimento

Università degli Studi del SALENTO - SCIENZE E TECNOLOGIE BIOLOGICHE ED AMBIENTALI - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giuseppe Dalessandro

Descrizione

La ricerca si focalizzerà su alcuni aspetti specifici della secrezione e della endocitosi correlati al rimodellamento dell’apoplasto durante i processi di crescita e differenziamento e nelle risposte di difesa della pianta. Le analisi saranno condotte attraverso l’uso di proteine marker fluorescenti, di inibitori e di mutanti dominanti negativi (DN) coinvolti negli eventi di riconoscimento e fusione delle vescicole secretorie ed endocitotiche. La valutazione comparata dei dati ottenuti sugli stessi marcatori permetterà di costruire un modello che spieghi, almeno in parte le complesse relazioni fra esocitosi, endocitosi e modificazioni all’apoplasto.

OBIETTIVI SPECIFICI DEL PROGETTO
1) Costruire nuovi marker fluorescenti per seguire: a) la secrezione al Golgi e alla membrana plasmatica di proteine coinvolte nel rimodellamento dell’apoplasto; b) gli eventi endocitotici correlati alla crescita e alla risposta a elicitori (peptide derivato dalla flagellina batterica, flg22, e oligogalatturonidi, OG).
2) Determinare la funzionalità di alcuni marker fluorescenti.
3) Determinare il ruolo di un’ancora di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) nella secrezione in parete.
4) Determinare il ruolo della N-glicosilazione negli eventi di targeting, secrezione e endocitosi.
5) Costruire mutanti DN per analizzare i meccanismi di secrezione ed endocitosi.
6) Ricercare segnali specifici per il targeting alla parete.

1. COSTRUZIONE DI NUOVI MARKER FLUORESCENTI
PRIMO ANNO
1.1. L’UR proponente è già in possesso del costrutto PGIP2-GFP (inibitore delle poligalatturonasi con localizzazione finale in parete) e di secGFP (forma secreta di GFP). Verranno costruiti nuovi marker fluorescenti per seguire in maniera specifica la secrezione al Golgi e alla membrana plasmatica di proteine coinvolte nella biosintesi dei polisaccaridi di parete. Saranno utilizzati i cDNA dei geni CslA02 (ipotetica funzione di beta-mannano sintasi) e CesA6 (subunità del complesso cellulosa sintasi) di Arabidopsis thaliana per effettuare delle fusioni con GFP. In collaborazione con le altre unità, verranno costruite: a) fusioni tra GFP e Air12 (UR IV), glicoproteina indotta da patogenesi legata alla faccia esterna della membrana plasmatica mediante un’ancora di GPI; b) fusioni tra GFP e AtPAO (UR I), e tra GFP e ZmPAO (UR I), poliammine ossidasi con localizzazione finale in parete. Il pattern di secrezione delle chimere verrà seguito attraverso osservazioni di microscopia confocale in protoplasti di Nicotiana tabacum trasformati in maniera transiente. Per verificare ulteriormente la localizzazione intracellulare delle chimere si effettueranno esperimenti di co-localizzazione utilizzando i coloranti BODIPY-TR (colorante specifico per il Golgi) e FM4-64 (colorante specifico per la membrana plasmatica e per l’endocitosi). Nella stessa ottica saranno condotti test in presenza di BFA, la droga fungina determina il disassemblaggio dei dittiosomi e una ridistribuzione delle proteine del Golgi nel RE con la formazione di aggregati noti con il termine di “BFA bodies”. La localizzazione finale dei costrutti sarà convalidata attraverso esperimenti in presenza di cicloesimide, questo inibitore della sintesi proteica verrà somministrato a diciotto ore di trasformazione transiente dei protoplasti con i marker fluorescenti. Il trattamento bloccherà la sintesi della chimera e renderà possibile la visualizzazione del costrutto fluorescente solo nel sito di localizzazione finale mentre la fluorescenza dovuta al transito della proteina nei diversi subcomparti cellulari non sarà più evidente. Le osservazioni saranno avvalorate da analisi biochimiche di immunoblot delle proteine isolate dalla frazione solubile, di parete e di membrana.
Le fusioni verranno inserite nel vettore binario pBIN19 per confermare il pattern di secrezione delle chimere fluorescenti in foglie di Nicotiana tabacum agroinfiltrate.
SECONDO ANNO
1.2. L’UR II costruirà dei recettori chimerici utilizzando la porzione extracellulare del recettore delle flagelline FSL2 e la porzione chinasica di EFR (recettore del PAMP Ef-TU). Compito dell’UR proponente è quello di effettuare le fusioni tra GFP e FSL2, EFR e le chimere FSL2/EFR ottenute dall’UR II. Questi costrutti rappresenteranno nuovi marker fluorescenti per seguire la dinamica recettoriale endocitotica in presenza o assenza di flg22 e OG. Il pattern di endocitosi verrà valutato su protoplasti di tabacco trasformati in maniera transiente e su foglie di tabacco agroinfiltrate mediante microscopia confocale e immunoblotting. Gli eventi endocitotici in risposta a flg22 e OG verranno convalidati attraverso esperimenti di co-localizzazione con il colorante specifico per l’endocitosi FM4-64.
L’endocitosi mediata da recettori (RME) è un processo ben noto nelle cellule animali ed è mediato da vescicole ricoperte da clatrina. In protoplasti di Arabidopsis è stato espresso il recettore della transferrina umana (hTfR) dimostrando che, come nelle cellule animali, questo ricicla tra la membrana plasmatica e i compartimenti endosomiali. Ciò è stato chiarito utilizzando tyrphostin A23, un omologo della tirosina che inibisce le tirosine chinasi. Tyrphostin A23 inibisce l’interazione tra le adattine e le proteine cargo senza interferire con l’assemblaggio dei rivestimenti di clatrina. In queste condizioni sperimentali, FM4-64 è internalizzato, ma non le proteine di membrana (Dhonukshe et al., 2007). È, inoltre, noto che la BFA, tra gli altri effetti, inibisce il riciclo fra gli endosomi e la membrana plasmatica e questo porta all’accumulo delle proteine di membrana in specifici compartimenti indotti da BFA (BFA-induced compartment) (Ortiz-Zapater et al., 2006). L’UR proponente verificherà l’effetto di tyrphostin A23 e della BFA sulle chimere GFP-FLS2, GFP-EFR e GFP-FSL2/EFR per verificare se il segnale mediato da fgl22 e OG implichi eventi di internalizzazione (con eventuale scopo finale di degradazione) o riciclo (con eventuale scopo di attivazione/disattivazione del recettore).

2. TEST DI FUNZIONALITA’ DEI MARKER FLUORESCENTI
PRIMO ANNO
2.1. La funzionalità di CslA02-GFP sarà testato isolando le membrane totali da protoplasti wt e protoplasti trasformati con la chimera e incubandole in presenza di GDP-[U-14C]mannosio. Eventuali variazioni nell’attività mannosil transferasi saranno valutate confrontando l’attività specifica dell’enzima ottenuta quantificando la radioattività incorporata nel polisaccaride sintetizzato in vitro.
SECONDO ANNO
2.2. L’UR II valuterà la possibilità che PGIP2 abbia un ruolo nella trasmissione del segnale mediata da OG attraverso l’uso di piante antisenso e sovraesprimenti PGIP. In collaborazione con l’UR II, l’UR proponente affronterà il problema attraverso microscopia confocale utilizzando il marcatore PGIP2-GFP. Se PGIP2 funge da co-recettore nella trasmissione del segnale mediata da OG, potrebbe essere coinvolta in eventi di internalizzazione similmente a quanto riportato per FLS2. Protoplasti e foglie intere di tabacco verranno trasformati con PGIP2-GFP in presenza di OG in modo da verificare attraverso microscopia confocale eventuali eventi di internalizzazione del costrutto. Anche in questo caso verranno effettuati esperimenti di co-localizzazione con FM4-64 e prove con gli inibitori tyrphostin A23 e BFA come riportato al punto 1.2.

3. RUOLO DI UN’ANCORA DI GLICOSILFOSFATIDILINOSITOLO (GPI) NELLA SECREZIONE IN PARETE
PRIMO ANNO
3.1. L’ancoraggio di una proteina al GPI viene ritenuto un segnale di targeting intracellulare per il trasporto alla membrana plasmatica ed al rilascio in parete attraverso l’azione di specifiche fosfolipasi. Con analisi di bioinformatica sono state identificate circa 250 proteine legate a GPI (GAP) con ipotetiche funzioni nel signalling cellulare, nell’adesione cellulare e nel rimodellamento dell’apoplasto e nei meccanismi di difesa. Ma solo su due GAP si hanno dati sperimentali relativi alla caratterizzazione funzionale (Gillmor et al., 2005). Per stabilire il ruolo dell’ancora di GPI sulla secrezione in parete si condurranno test in presenza di mannosamina. Questo aminozucchero blocca la sintesi di GPI e l’incorporazione di GPI glicani nelle proteine GPI-ancorate senza alterare la sintesi delle proteine e la loro glicosilazione (Sütterlin et al., 1997). I marker fluorescenti (fusioni tra GFP e PGIP2, CesA6, ClsA02, PAO, Air12) verranno espressi in maniera transiente in protoplasti e foglia di tabacco e simultaneamente trattati con mannosamina per verificare eventuali variazioni nel pattern di secrezione. Le osservazioni di microscopia confocale verranno supportate da specifiche analisi biochimiche. Si procederà alla separazione dei subcomparti cellulari in modo da riuscire ad evidenziare il compartimento in cui vengono bloccati i marker di secrezione utilizzati. Si isoleranno le proteine di parete, le proteine vacuolari, citosoliche, solubili e integrali di membrana.
SECONDO ANNO
3.2. Si verificherà l’effetto della mannosamina sulla secrezione delle fusioni tra GFP e FLS2, EFR e FLS2/EFR secondo l’approccio sperimentale riportato in 3.1.

4. RUOLO DELLA N-GLICOSILAZIONE NEGLI EVENTI DI TARGETING, SECREZIONE ED ENDOCITOSI
PRIMO ANNO
4.1. E’ stato riportato che la N-glicosilazione è un evento fondamentale per la biosintesi della parete e che un blocco di questi eventi determina alterazioni fenotipiche importanti (Lerouxel et al., 2005). I mutanti hanno evidenziato alterazioni negli enzimi coinvolti nell’assemblaggio e/o nel processing delle catene oligosaccaridiche N-linked nel reticolo endoplasmico. Nella via secretoria il processing delle catene oligosaccaridiche N-linked risulta essere essenziale per il sorting delle proteine secrete e per le proteine intrinseche di membrana. Molti aspetti del ruolo della N-glicosilazione nelle proteine vegetali devono ancora essere chiariti. Le proteine oggetto del presente studio presentano uno o più siti di glicosilazione. Per verificare se gli eventi di N-glicosilazione svolgono un ruolo importante per lo smistamento delle proteine coinvolte nel rimodellamento dell’apoplasto, verranno effettuati esperimenti in presenza di tunicamicina, noto inibitore della glicosilazione nelle proteine N-linked. Protoplasti trasformati in maniera transiente con i marker di secrezione PGIP2-GFP, CesA6-GFP, CslA02-GFP, GFP-PAO e Air12-GFP saranno trattati con tunicamicina per evidenziare eventuali variazioni nel pattern fluorescente di secrezione correlate all’assenza della porzione oligosaccaridica. L’immunonoblotting delle proteine isolate dalle frazioni subcellulari: parete, membrane e solubile permetterà di evidenziare la presenza di forme non glicosilate e la loro localizzazione.
SECONDO ANNO
4.2 Indagini in presenza di tunicamicina verranno effettuate su protoplasti trasformati con le fusioni GFP-FLS2, GFP-EFR e GFP-FLS2/EFR per verificare variazioni nella localizzazione dei costrutti o eventuali differenze negli eventi di internalizzazione in seguito a trattamento con flg22 e OG. L’UR I si propone di ottenere un mutante sito specifico di glicosilazione di ZmPAO (Asn105Ser). In collaborazione con l’UR I si costruirà la proteina di fusione GFP-Asn105Ser, il cui pattern di secrezione sarà seguito in protoplasti e foglie di tabacco per verificare il ruolo della catena oligosaccaridica nel sorting all’apoplasto.
5. COSTRUZIONE DI MUTANTI DN PER ANALIZZARE I MECCANISMI DI SECREZIONE ED ENDOCITOSI.
PRIMO ANNO
5.1. L’UR proponente ha caratterizzato l’effetto di alcune SNARE (SYP121, SYP122, SNAP33, SytA) e Rab (Rab11a) sull’attività secretoria in protoplasti di tabacco. Queste proteine sono coinvolte in aspetti diversi ed in parte anche correlati al trasporto verso la membrana plasmatica e, quindi, verso l’apoplasto. Ognuna di queste proteine è espressa secondo profili di espressione parzialmente sovrapposti, con localizzazione subcellulare analoga e con caratteristiche biochimiche spesso simili. Studi condotti utilizzando Sp2, mutante DN di SYP121, hanno evidenziato che SYP121 è implicata nella secrezione di secGFP (una forma secreta di GFP, marker fluorescente di secrezione attraverso la via di default), ma non nella secrezione dei polisaccaridi di parete (Leucci et al. , 2007). Nuove tipologie di mutanti DN, sia su SYP121 (Di Sansebastiano et al., 2006) che su SYP122 mostrano come sia possibile combinare studi biochimici e di microscopia in grado di metterne in luce differenze altrimenti non rilevabili. Le fusioni PGIP2-GFP, GFP-CesA6, GFP-Cls02, GFP-PAO e GFP-Air12 verranno coespresse con i mutanti DN di SYP122 e SYP121 in quanto elementi chiave del targeting alla membrana plasmatica.
SECONDO ANNO
5.2. Si chiarirà il ruolo delle proteine Rab sia perché determinano la specificità del traffico di membrana (Rutherford and Moore, 2002), sia perché sembrano possedere la capacità di potenziare i meccanismi di difesa della pianta (Agarwal et al., 2007). Si studierà il ruolo di Rab11a (probabilmente sul TGN), RabA2 e RabA3 (TGN/EE), RabA5 (TGN-PM), RabF2 (LE/PVC) (Zheng et al., 2005). Tutti gli esperimenti saranno condotti inizialmente con la co-espressione transiente in protoplasti di tabacco dei mutanti DN con marcatori esogeni dell’esocitosi, secGFP e secRGUS, per poi estendere lo studio ai marcatori di parete e ai recettori specifici sviluppati nell’ambito del progetto.

6. RICERCA DI SEGNALI SPECIFICI PER IL TARGETING ALLA PARETE.
SECONDO ANNO
6.2. Per ricercare segnali di targeting per la parete, verranno effettuate delle fusioni tra GFP e frammenti di PGIP2 e ZmPAO. Verranno costruite fusioni utilizzando la porzione C- o N-terminale delle glicoproteine di parete, includendo le porzioni altamente conservate che potrebbero avere un ruolo determinante nel targeting all’apoplasto. L’UR proponente studierà il possibile ruolo nel trasporto all’apoplasto della porzione N-terminale di PGIP2 costruendo una chimera tra GFP e i primi 40 amminoacidi di PGIP2, che comprendono il peptide di inserzione nella via di secrezione e il dominio N-terminale della proteina matura (Leckie et al., 1999). In collaborazione con l’UR I, si costruiranno due proteine di fusione tra GFP e la porzione C-terminale di ZmPAO che presenta due cisteine implicate nella formazione di ponti disolfuro che potrebbero essere importanti per il sorting all’apoplasto. Si costruiranno due fusioni: una composta da GFP e la porzione C-terminale di ZmPAO contenente le due cisteine in posizione 457 e 463 e l’altra composta da GFP e dalla porzione C-terminale di ZmPAO contenente solo la cisteina in posizione 463. Il pattern di secrezione di questi costrutti verrà seguito attraverso osservazioni di microscopia confocale e analisi di immunoblotting su protoplasti e foglie di tabacco.