RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - BIOLOGIA VEGETALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giulia De Lorenzo

Descrizione

Questo progetto si propone di chiarire i meccanismi alla base dell’azione degli OG nella difesa e nell’organogenesi. Si divide in 3 attività principali:
A. ANALISI DELLA VIA DI SEGNALAZIONE ATTIVATA DAGLI OG
B. IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEI RECETTORI DEGLI OG
C. ANALISI DEI LIVELLI DI OG IN PLANTA

A. ANALISI DELLA VIA DI SEGNALAZIONE ATTIVATA DAGLI OG.
Nel corso del programma PRIN 2005, analisi del trascrittoma di Arabidopsis hanno mostrato che, mentre le risposte precoci agli OG e flg22 (1 h) sono ampiamente sovrapponibili (>98%), quelle più tardive (3 e 6 h) divergono notevolmente, essendo l’espressione di almeno 4000 geni regolata solo da flg22. Sono stati analizzati in via preliminare e mediante RT-PCR semiquantitativa (sqRT-PCR), diversi geni utili come marcatori della risposta agli OG e flg22.
A.1. ANALISI DI MUTANTI
A.1.1. (I anno). L’espressione di geni marcatori scelti sulla base dei dati di microarray (tra cui Air12, oggetto del programma di ricerca dell’UR IV) verrà analizzata mediante RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) in risposta ad OG e flg22, e possibilmente ad altri elicitori non specifici e a B. cinerea (analisi dose-effetto e cinetiche temporali di espressione). Verranno anche caratterizzati almeno due marcatori utili per distinguere la risposta a flg22 da quella agli OG.
A.1.2. (I anno). Verrà analizzato il ruolo di JA, SA ed Et nell’induzione dell’espressione dei geni marcatori utilizzando i mutanti ein2, jar1, npr1 (insensibili ad Et, JA e SA, rispettivamente), il mutante coi1 (insensibile al JA) e il triplo mutante ein2jar1npr1.
A.1.3. (I anno). Verrà studiato il ruolo della NADPH ossidasi di membrana AtrbohD nell’induzione mediata da OG del burst ossidativo, dell’espressione dei geni marcatori e della protezione contro il fungo patogeno Botrytis cinerea utilizzando il corrispondente mutante KO.
A.2. L’ANTAGONISMO OG/AUXINA NELLE RISPOSTE REGOLATE DAGLI OG.
Studi condotti nel nostro laboratorio hanno messo in evidenza un’interazione antagonistica tra OG e auxina. Sinora, tale antagonismo è stato descritto solo in tabacco (1,2,3,18). Intendiamo chiarire il ruolo svolto dall’auxina nelle risposte regolate dagli OG in Arabidopsis.
A.2.1. (I anno) Esperimenti preliminari hanno mostrato una attività inibitoria degli OG sulla formazione di radici avventizie indotta dal trattamento con auxina in espianti fogliari di Arabidopsis. Verranno messe a punto le condizioni ottimali per osservare tale attività inibitoria; verrà inoltre determinato il grado di polimerizzazione degli OG attivi e si determinerà la cinetica temporale della loro azione.
A.2.2. (I anno) Verrà determinato se l’auxina riduce la protezione contro B. cinerea indotta dagli OG in Arabidopsis e tabacco. In caso positivo, l'induzione della protezione da parte degli OG verrà analizzata in mutanti auxinici di Arabidopsis.
A2.3. (I anno) Le analisi trascrittomiche mostrano che diversi geni, noti per essere indotti dall’auxina, sono repressi dagli OG. Mediante qRT-PCR si valuterà se la regolazione dell’espressione di questi geni rifletta l’antagonismo OG/auxina.
A.2.4 (I anno) Analogamente a flg22 (19), gli OG reprimono l’espressione dei recettori dell’auxina. Intendiamo confermare tale repressione mediante qRT-PCR sia su espianti fogliari che su plantule e determineremo se, come nel caso di flg22, sia correlata all’induzione di miR393.
A.2.5. (II anno) Si valuterà da un lato se piante transgeniche che sovraesprimono miR393 sono più resistenti a B. cinerea, e dall’altro se gli OG inducono protezione in mutanti alterati nella formazione dei miRNA e di altri RNA regolativi (dcl-1, dcl-2 e dcl-3) (19).
A.2.6 (II anno). Verrà analizzato l’antagonismo OG/auxina mediante analisi dell’espressione di geni marcatori, della rizogenesi avventizia e della protezione contro B. cinerea in piante KO Air12 (in collaborazione con l’UR IV) e in piante alterate nell’espressione di ammino ossidasi ottenute dall’unità I.
A.2.7 (II anno). L’espressione del gene Air12 è indotta da auxina nelle radici laterali in formazione (17,20); è anche indotta sia da OG che da B. cinerea. In collaborazione con l’UR IV, linee transgeniche che esprimono il gene reporter GUS sotto il controllo del promotore Air12 verranno caratterizzate per la loro risposta agli OG ed auxina. Verrà anche studiata l’espressione di questo gene durante la rizogenesi avventizia indotta da IAA in espianti fogliari.
A.2.8. (II anno) La rizogenesi avventizia verrà studiata nelle piante transgeniche alterate nell’espressione delle ammino ossidasi ottenute dall’UR I.


B) IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEI RECETTORI DEGLI OG. Uno degli obiettivi più ambiziosi di questo progetto è l’identificazione del recettore degli OG. A questo scopo verranno impiegati approcci sia biochimici che di genetica inversa.
B.1. APPROCCIO BIOCHIMICO UTILIZZANDO OG MARCATI
B.1.1. (I anno). E’ noto che è possibile marcare l’estremità riducente di oligosaccaridi (25). Verranno marcati OG con molecole quali la biotina-idrazide e la biotina-amidocaproil-idrazide e molecole fluorescenti quali l’antranilamide. Gli OG marcati con biotina verranno purificati mediante colonne di affinità (per es. sfruttando l’ interazione biotina-streptavidina) o precipitazione con etanolo e cromatografia a scambio ionico e analizzati mediante MALDI-ToF.
B.1.2. (I anno). Gli OG marcati verranno impiegati per il trattamento di protoplasti, plantule o espianti fogliari di Arabidopsis o di tabacco, per valutarne l’attività. Verrà analizzata l’espressione dei geni marcatori mediante RT-PCR semiquantitativa.
B.1.2. (II anno). In collaborazione con l’RU V, gli OG marcati con fluorofori verranno impiegati nel trattamento di protoplasti, plantule o espianti fogliari di Arabidopsis o di tabacco, per studiare la dinamica di interazione col recettore di membrana mediante microscopia confocale a fluorescenza.
B.1.3. (II anno) Gli OG marcati con biotina verranno impiegati nel trattamento di protoplasti, plantule o espianti fogliari di Arabidopsis o di tabacco, per l’individuazione di proteine con alta affinità di legame agli OG. Verranno isolati microsomi totali e proteine capaci di legare gli OG verranno purificate tramite affinità biotina-streptavidina. Verranno anche condotti esperimenti di “cross-link” chimico. Le proteine isolate verranno caratterizzate mediante LC-MS.
B.2. ANALISI DI MUTANTI KO PER RECETTORI CHINASICI
Per l’identificazione del recettore degli OG, oltre all’approccio biochimico, verrà adottato anche un approccio basato sull’analisi di mutanti KO per presunti recettori. Un limite di questo approccio è la possibile ridondanza nei recettori degli OG, che potrebbe mascherare l’effetto della mutazione di un singolo gene. Le analisi verranno condotte utilizzando dosi basse di OG e prestando attenzione anche a differenze solo quantitative nelle risposte.
B.2.1 (I anno) Un’analisi proteomica differenziale dei “lipid rafts” isolati da calli di Arabidopsis trattati con OG, condotta nell’ambito del PRIN 2005, ha messo in evidenza un aumento della presenza di un recettore chinasico con un dominio LysM (LysM RK). Recettori LysM sono coinvolti nel riconoscimento dei fattori NOD dei rizobi e dei frammenti di chitina (16). Linee KO per tutti i LysM-RK di Arabidopsis verranno portate ad omozigosi ed analizzate per le risposte agli OG.
B.2.2. (I e II anno) Possibili recettori degli OG verranno identificati anche sulla base dell’ipotesi che, in analogia con la maggior parte dei recettori del sistema immunitario innato delle piante e ai recettori dei frammenti di ialuronano negli animali, il recettore degli OG contenga un dominio extracellulare LRR, omologo alla PGIP ed a FLS2. Linee omozigoti KO per LRR-RLK ottenute da collaboratori europei verranno analizzate per le risposte agli OG. L’analisi includerà anche il mutante bak1.
B.2.3. (II anno) Le linee interessanti, nel caso vengano riscontrate solo alterazioni quantitative nella risposta, verranno incrociate per ottenere doppi e tripli mutanti, che verranno a loro volta analizzati per le risposte agli OG.
B.3 RUOLO DELLA PGIP NELLA SEGNALAZIONE MEDIATA DA OG.
E’ stato dimostrato che la PGIP è in grado di interagire sia con l’acido poligalatturonico (PGA) che con OG e che l’interazione dipende da un allineamento di cariche positive regolarmente distribuite nella struttura della PGIP (26).
B.3.1. (I anno) Per valutare la possibilità che la stessa PGIP abbia un ruolo come co-recettore nella segnalazione mediata da OG, verranno analizzate le risposte a questi elicitori [espressione di geni marcatori e inibizione della rizogenesi avventizia in presenza di auxina (vedi punto A.2] in piante antisenso e sovraesprimenti PGIP, già disponibili.
B.3.2 (II anno) In collaborazione con l’UR V verranno condotte analisi di microscopia confocale per valutare la dinamica di internalizzazione di OG fluorescenti in protoplasti che esprimono una fusione PGIP-GFP, ottenuta nell’ambito del PRIN 2005.
B.4. RECETTORI CHIMERICI
Il ruolo nella percezione degli OG di potenziali recettori identificati in questo progetto dovrà essere confermato con ulteriori esperimenti. La complementazione funzionale potrà essere utilizzata nel caso di linee KO con alterate risposte agli OG. Nel caso di candidati identificati con l’approccio biochimico, potranno essere analizzate linee KO nei corrispondenti geni. Ulteriori conferme del ruolo di un recettore potrebbero essere ottenute qualora la sovraespressione del solo dominio extracellulare (ectodominio) interferisse con la segnalazione da parte del corrispondente ligando. Una “prova di un concetto” (“test-of-concept”) a questo riguardo è stata proposta nel precedente COFIN, utilizzando il sistema modello FLS2/flg22, ed è in via di svolgimento.
Un approccio alternativo è rappresentato dall’espressione di un recettore chimerico costituito dal dominio extracellulare del candidato recettore e la porzione chinasica di un recettore noto e di cui sia stata caratterizzata la risposta. Tuttavia, sinora è stato pubblicato solo un lavoro, peraltro controverso, su un recettore chimerico funzionale di questo genere (13).
Nell’ambito di questo COFIN si intende intraprendere una seconda “prova di concetto” e si propone di verificare se recettori chimerici FLS2-EFR siano funzionali. EFR è noto come il recettore del PAMP Ef-Tu e del peptide da esso derivato elf18 (27); il riconoscimento elf18/EFR innesca una risposta sovrapponibile per oltre il 98% a quella attivata dall’interazione flg22/FLS2. In caso di successo, si preparerà un recettore chimerico costituito dalla regione extracellulare del candidato recettore degli OG e la porzione chinasica di EFR. Questo, a seguito del riconoscimento degli OG dovrebbe attivare l’espressione dei marcatori dell’attivazione di EFR (ed FLS2) che non sono normalmente indotti dagli OG.
B.4.1. (I anno) Verranno costruiti almeno due recettori chimerici costituiti dalla porzione extracellulare di FLS2 e la porzione chinasica di EFR, con punti di giunzione diversi nell’ambito del dominio proteico comprendente la regione esterna prossimale alla membrana (eJM), la porzione transmembrana (TM) e la regione interna prossimale alla membrana (iJM). Ciascuno dei due recettori verrà anche fuso con GFP. Per controllo verranno preparate anche le fusioni FLS2-GFP e EFR-GFP.
B.4.2. (II anno) In collaborazione con l’UR V, l’espressione delle fusioni recettori-GFP verrà valutata mediante espressione transiente in protoplasti o in foglie di tabacco o Arabidopsis, e analisi di immunoblot e microscopia confocale. Verrà valutato se sia possibile mettere in evidenza le dinamiche dei recettori (endocitosi) a seguito del riconoscimento del ligando specifico.
B.4.3. (II anno) I recettori chimerici verranno espressi stabilmente in Arabidopsis. Le chimere FLS2:EFR (con e senza GFP) e FLS2:GFP verranno espresse nell’ecotipo Ws, che possiede una mutazione nel gene endogeno FLS2 e quindi non risponde a flg22 (28). Se i recettori ricombinanti sono funzionali, il trattamento con flg22 dovrebbe indurre l’espressione dei geni marcatori. La fusione EFR:GFP verrà invece espressa nel mutante efr, che manca di EFR funzionante e non risponde ad elf18.
B.4.4. (II anno) Plantule transgeniche di Arabidopsis che esprimono i recettori chimerici fusi con GFP verranno trattate con flg22 e analizzate mediante microscopia confocale per osservare l’eventuale endocitosi, e mediante RT-PCR quantitativa per analizzare l’espressione dei geni marcatori, in collaborazione con l’UR V.


C. ANALISI DEI LIVELLI DI OG IN PLANTA
Alcuni degli strumenti biologici sviluppati nel corso di questo progetto verranno utilizzati per mettere a punto un protocollo per la misurazione diretta dei livelli di OG in vivo.
D.1. (I anno) Inizialmente verrà messa a punto una procedura per l’estrazione di OG nei fluidi extracellulari (IWF) utilizzando foglie di tabacco infiltrate con OG (anche marcati). Verrà determinato il contenuto di acidi uronici o la presenza degli OG marcati negli IWF. Il grado di polimerizzazione, l’abbondanza relativa e l’eventuale metilazione degli OG estratti verrà analizzata tramite MALDI-ToF dopo purificazione per cromatografia a scambio ionico.
D.2 (I anno) Espianti fogliari di piante di tabacco che esprimono un gene chimerico costituito dal promotore, inducibile da auxina, del gene rolB di Agrobacterium rhizogenes (rolB::GUS) sono stati utilizzati per caratterizzare l’antagonismo tra auxina e OG (1). Verrà valutata la possibilità di determinare indirettamente la presenza e i livelli di OG negli IWF tramite tale biosaggio.
D.3. (II anno). Si intende sviluppare un sistema ad alta sensibilità di rilevamento degli OG basato su proteine che posseggono siti di legame per gli OG, quali la PG (per la quale gli OG rappresentano un substrato) o la PGIP (26). Nel caso della PG, verrà impiegata una variante inattiva mutata in un singolo aminoacido a livello del sito catalitico. L’interazione di queste proteine con OG biotinilati verrà caratterizzata in varie condizioni di forza ionica e di pH (vedi punto A.3.4), mediante analisi di risonanza plasmonica di superficie. Verranno effettuati esperimenti di competizione degli OG presenti in un campione di interesse con gli OG marcati legati alla PGIP o PG immobilizzate per valutarne l’utilizzo come biosaggio.