RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE

Università di riferimento

Università degli Studi di BOLOGNA - BIOLOGIA EVOLUZIONISTICA SPERIMENTALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Paolo Pupillo

Descrizione

Il progetto ha come obiettivo principale la caratterizzazione molecolare e fisiologica di Air12, il primo citocromo b ad elevato potenziale identificato finora in membrane plasmatiche vegetali. Un’accurata caratterizzazione biochimica di questa proteina contribuirà alla comprensione di una nuova famiglia di citocromi, distribuiti in organismi diversi e apparentemente coinvolti in funzioni fisiologiche molto diverse. Nelle piante, si cercherà di comprendere il ruolo svolto dalla proteina Air12 e dalle proteine redox che interagiscono con Air12 nella regolazione dello stato redox dell’apoplasto e nel processo di formazione delle radici laterali.

L’auxina determina un forte controllo positivo su questo processo morfogenetico. Molecole di altra natura, come ad esempio oligogalatturonidi derivati dalla digestione parziale dei poligalatturonani di parete (vedi UR II), interferiscono negativamente sul controllo auxinico. Specie reattive dell’ossigeno (vedi UR I) e ascorbato apoplastico sono coinvolte nei processi di crescita e differenziamento, ma il ruolo dei sistemi redox della membrana plasmatica e nella regolazione dello stato redox dell’apoplasto è ancora poco noto.

Il coinvolgimento di Air12 in meccanismi di trasporto elettronico trans-membrana plasmatica, implica una sua capacità di interagire con altre proteine redox. Il folding di Air12 (beta sandwich, noto come DOMON, Aravind 2001) suggerisce anch’esso capacità di interazione con altri partner molecolari ed è presente in altre proteine redox, (i) in associazione con un dominio flavinico come nella cellobiosio deidrogenasi di funghi ligninolitici (Zamocky et al. 2006), o (ii) con un’ossidasi a rame come nella dopamina beta monossigenasi dei mammiferi (Rosenzweig e Sazinsky 2006) o (iii) legato ad un dominio citocromo b561 (proteine CY-DOM, Aravind 2001; Verelst e Asard 2004; Tsubaki et al 2005). Per il “principio della Stele di Rosetta”, Marcotte et al. 1999; Enright et al. 1999) è possibile supporre che i partner molecolari di Air12 abbiano natura simile ai domini con i quali il dominio DOMON di Air12 interagisce all’interno di proteine più complesse. Recenti evidenze sperimentali supportano questa ipotesi. Air12 in radici di Medicago truncatula è associata a raft lipidici (Lefebvre et al. 2007) all’interno dei quali sono presenti anche altre proteine redox fra cui una flavoproteina FQR1 (Laskowski et al. 2002), una ossidasi a rame SKU5 (Borner et al. 2003) e una proteina CY-DOM. Nei sistemi animali si ritiene che le proteine dei raft lipidici formino supercomplessi coinvolti in fenomeni di signalling (Touyz 2006). La possibile associazione funzionale tra Air12, FQR1 e SKU5 è ulteriormente supportata dal fatto che i tre geni sono indotti in modo e tempi simili da auxina nelle radici laterali in formazione (Laskowski et al. 2006). Inoltre, nei nostri tentativi di purificazione di citocromi della membrana plasmatica, Air12 è stato trovato co-purificare con SKU5 sia in fagiolo che in soia (dati non pubblicati).
Considerando l’insieme di questi dati sembra ragionevole ipotizzare, e quindi sottoporre a verifica sperimentale, che Air12 interagisca all’interno dei raft lipidici con altre proteine redox durante la formazione indotta da auxina delle radici laterali.

Il progetto prevede l’utilizzo di due specie: Arabidopsis e soia. I geni che codificano per Air12 in queste specie sono At3g07390 (Arabidopsis thaliana) e TC204251 (Glycine max), i rispettivi cDNA sono già disponibili nel nostro laboratorio. Sono inoltre già stati sviluppati dei protocolli di espressione eterologa di Air12 ricombinante. Tutte le tecniche di purificazione di proteine di membrana, caratterizzazione cinetica e termodinamica, e studio delle interazioni molecolari sono già ampiamente acquisite nell’UR.

OBIETTIVI SPECIFICI

1. Produzione di Air12 ricombinante, caratterizzazione biochimica e strutturale
La purificazione di Air12 da membrane plasmatiche di ipocotili eziolati di soia è estremamente impegnativa in termini di tempo e costi, e poco soddisfacente per la bassa resa finale in proteine pura. L’espressione eterologa è indispensabile per una approfondita caratterizzazione funzionale e strutturale della proteina. Al momento abbiamo disponibile il protocollo di espressione eterologa di Air12 di soia in E.coli, prevalentemente in corpi di inclusione, e in Pichia pastoris, che secerne la proteina in conformazione nativa, ma a bassa concentrazione, nel mezzo di coltura.

Primo anno
I protocolli di espressione eterologa di Air12 di soia in E.coli e in P.pastoris saranno ottimizzati per ottenere quantità maggiori di proteina ricombinante in conformazione nativa. Per lo stesso scopo, si potrà eventualmente ricorrere anche all’espressione in Nicotiana benthamiana infettata con virus PVX opportunamente ingenierizzato (collaborazione con UR I). La proteina ricombinante, anche in forma denaturata dopo purificazione dai corpi di inclusione, sarà utilizzata per la produzione di anticorpi policlonali. La proteina in forma nativa sarà accuratamente caratterizzata a livello biochimico per quanto concerne l’interazione con donatori (ascorbato, chinoli) e accettori elettronici a basso peso molecolare (monodeidroascorbato, ossigeno), con particolare interesse verso la possibile formazione di ROS (collaborazione con UR I). I risultati saranno supportati da un’analisi termodinamica del potenziale redox dell’eme. Il clone cDNA e gli anticorpi per Air12 (che è glicosilata e contiene un’ancora GPI), saranno resi disponibili all’UR V per gli studi di indirizzamento alla membrana plasmatica.


Secondo anno
A livello strutturale si verificherà lo stato di glicosilazione (solo per la proteina prodotta in P.pastoris o in pianta) e i residui coinvolti nella coordinazione dell’eme saranno individuati mediante mutagenesi sito specifica (è probabile che siano coinvolti, caso piuttosto raro per un citocromo b, una metionina e una istidina, come nella cellobiosio deidrogenasi fungina, Zamocky et al. 2006). Se la proteina ricombinante in forma nativa sarà ottenuta in sufficiente quantità si condurranno test di cristallizzazione per la successiva analisi diffrattometrica ai raggi X in collaborazione con l’UR III, inoltre sarà possibile verificare la prevista struttura beta-sandwich (Aravind 2001) mediante spettroscopia a dicroismo circolare.

Risultati attesi

Primo anno
1.1 Ottenimento di Air12 ricombinante purificata in forma nativa e rispettivi anticorpi.

Primo e secondo anno
1.2 Descrizione delle principali proprietà funzionali e strutturali di Air12 (ricombinante) di soia in vitro. Possibile determinazione della struttura tridimensionale.

Secondo anno
1.3 Sulla base delle caratteristiche di Air12 e di proteine note che contengono il dominio DOMON, definizione delle principali proprietà di questa nuova famiglia di citocromi.

2. Localizzazione in pianta di Air12
Esperimenti di microarray e di proteomica indicano che Air12 è espressa nelle radici, particolarmente nelle radici laterali in formazione, dove l’espressione è indotta da auxina. E’ necessario verificare questo dato con maggiore definizione spaziale e temporale nella pianta intera.

Primo anno
Piante di Arabidopsis saranno trasformate stabilmente mediante Agrobacterium tumefaciens con un costrutto che comprende il promotore di Air12 a monte del gene reporter GUS. Il clonaggio del promotore di Air12 in Arabidopsis sarà effettuato per PCR.

Secondo anno
L’espressione di Air12 sarà osservata mediante colorazione GUS in diversi stadi di sviluppo della radice e sotto l’effetto di diversi trattamenti che influiscono sulla rizogenesi (auxine, oligalatturonidi, brassinosteroidi, collaborazione con UR II).

Risultati attesi

Primo anno
2.1 Clonaggio del promotore di Air12 di Arabidopsis
2.2 Piante transgeniche di Arabidopsis con gene reporter GUS sotto il controllo del promotore endogeno di Air12

Secondo anno
2.3 Definizione delle condizioni, dei tessuti e degli stadi di sviluppo in cui Air12 è maggiormente espressa

3. Caratterizzazione fenotipica di linee T-DNA di Arabidopsis per Air12 e potenziali interattori
Il ruolo fisiologico di Air12, in particolare nel processo di formazione delle radici laterali, sarà valutato mediante analisi fenotipica di una linea T-DNA in cui l’espressione di Air12 è virtualmente nulla. Inoltre, siccome l’attività redox di Air12 potrebbe coinvolgere diversi partner molecolari tra cui FQR1 e SKU5 (vedi sopra), linee T-DNA per ognuno di questi geni saranno analizzate in modo analogo.

Primo anno
Linee T-DNA con inserzioni in un esone sono disponibili per i geni Air12 (At3g07390), FQR1 (At5g54500) e SKU5 (At4g12420). Linee omozigoti saranno selezionate a partire dai semi T1 e fenotipizzate. Particolare attenzione sarà dedicata all’analisi dello sviluppo delle radici laterali (indotta o no da auxine, o in presenza di oligogalatturonidi, collaborazione con UR II) e all’attività redox radicale misurata in vivo (collaborazione con UR I). L’eventuale osservazione di analogie fenotipiche tra linee mutanti differenti deporrà a favore di un comune coinvolgimento in una catena redox attivata durante la formazione delle radici laterali o in altre condizioni.

Secondo anno (se necessario)
Nel caso di fenotipi particolarmente interessanti, si verificherà il recupero del fenotipo wild type in seguito a trasformazione del mutante con il gene wild type. Inoltre, in alcuni casi potrà essere interessante ottenere per incrocio mutanti multipli per verificare eventuali effetti additivi sul fenotipo.

Risultati attesi

Primo anno
3.1 Isolamento linee T-DNA omozigoti per Air12, FQR1, SKU5
3.2 Caratterizzazione fenotipica delle linee mutanti omozigoti

Secondo anno (se necessario)
3.3 Recupero del fenotipo wild type mediante reintroduzione del gene
3.4 Ottenimento mutanti multipli per incrocio

4. Air12 e possibili complessi redox nei raft lipidici.
Sulla base delle considerazioni esposte in precedenza, è probabile che Air12 interagisca con specifici partner molecolari, se non altro per consentire il trasporto redox trans-membrana nel quale è coinvolto. La presenza di Air12 e di altre proteine redox nei raft lipidici potrebbe avere un ruolo importante in questo senso (Lefebvre et al. 2007).

Primo anno
Il primo approccio sperimentale si avvarrà degli anticorpi prodotti contro Air12 (punto 1.1). Da radici di soia allevata in idroponica sarà ottenuta una preparazione di raft lipidici seguendo protocolli consolidati per altre specie tra cui Medicago truncatula (Lefebvre et al. 2007). In seguito a solubilizzazione delle raft con octil-glucoside ed eventuale estrazione di steroli con ciclodestrine (Babiychuk and Draeger, 2006), si tenterà l’isolamento di complessi che contengono Air12 mediante immunoprecipitazione. Questo passaggio potrà essere ottimizzato mediante stabilizzazione preventiva dei complessi con agenti cross-linkanti. L’identificazione finale delle proteine interagenti con Air12 sarà effettuata mediante MALDI-TOF, sfruttando la conoscenza di più di 330.000 ESTs di soia depositate in TIGR.

Secondo anno
E’ possibile che l’individuazione di interattori di Air12 mediante immunoprecipitazione con anticorpi anti-Air12 possa rivelarsi problematica a causa di un riconoscimento non sufficientemente efficiente da parte degli anticorpi. In questo caso si farà un costrutto in cui la regione codificante Air12 di soia sarà preceduta da una sequenza che codifica per un epitopo HA adatto alla successiva immunoprecipitazione con anticorpi specifici commerciali. ll costrutto sarà clonato in un vettore binario sotto il controlllo del promotore 35S per la trasformazione di piante di soia mediata da Agrobacterium tumefaciens. Gli esperimenti di individuazione di interattori di Air12 in raft lipidici saranno effettuati come sopra descritto per le piante wild type.

Risultati attesi

Primo anno
4.1 Messa a punto di protocollo di purificazione di raft lipidici da radici di soia
4.2 Individuazione di eventuali interattori di Air12

Secondo anno (se necessario)
4.3 Piante transgeniche di soia che esprimono Air12-HA
4.4 Individuazione di eventuali interattori di Air12 nel caso di insuccesso del punto 4.2

5. Verifica delle interazioni in vitro

Alcuni possibili interattori, individuati come al punto 4, o suggeriti da analisi fenotipiche delle linee T-DNA come al punto 3, saranno verificati in vitro in seguito ad espressione delle forme ricombinanti in sistemi eterologhi. Per le proteine idrofiliche e non glicosilate o altrimenti modificate (es. ancora GPI) si utilizzerà E.coli come prima scelta. Alternativamente si passerà a Pichia pastoris, in particolare per le proteine glicosilate e/o idrofobiche. Si tenteranno ricostituzioni in vitro con o senza liposomi o in presenza di detergenti e si misurerà una serie di possibili reazioni redox suggerite dalla natura delle proteine interagenti. La formazione e la stechiometria dei complessi multiproteici sarà verificata mediante misura in linea di light scattering (MALS-QELS) sull’eluato di una colonna cromatografica ad esclusione molecolare.

Risultati attesi

Secondo anno
5.1 Purificazione di interattori di Air12 in forma ricombinante
5.2 Ricostituzione dei complessi, stechiometria e analisi funzionale dell’attività redox