RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

ANTAGONISTI DEI RECETTORI DI BV8/PROCHINETICINE: MODELLI PER NUOVI FARMACI ANALGESICI, ANTIINFIAMMATORI ED IMMUNOMODULATORI

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - FISIOLOGIA UMANA E FARMACOLOGIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Lucia Negri

Descrizione

Nell’ambito del programma PRIN 2007 “Antagonisti dei recettori delle prochineticine: modelli per nuovi farmaci analgesici, antiinfiammatori ed immunomodulatori” questa unità di ricerca si occuperà di caratterizzare farmacologicamente "in vitro", su colture cellulari, e di valutare "in vivo", in modelli animali di dolore cronico, le proprietà analgesiche ed antiinfiammatorie di nuove molecole peptidiche e non-peptidiche con funzione di antagonisti dei recettori delle prochineticine, PK-R1 e PK-R2.
Il composto di riferimento sarà un analogo di Bv8 progettato e prodotto nell’ambito del precedente progetto di ricerca finanziato dal MIUR mediante la tecnica di DNA ricombinante, denominato [Ala24]Bv8, per cui abbiamo depositato domanda di brevetto, come “antagonista dei recettori delle Prochineticine da usarsi nel trattamento del dolore” (Titolare: Università La Sapienza di Roma; Inventore: Negri Lucia, brevetto RM2007A000182). Si tratta della stessa sequenza di Bv8 in cui in posizione 24 il triptofano è stato sostituito con alanina.
Come antagonisti non peptidici studieremo derivati triazinici (1,3,5,-triazine) sostituiti e quelli ottenuti con sostituzioni nei modelli strutturali triazinici e pirimidinici che saranno sintetizzati dalla Unità di Ricerca 2 (Balboni, Università di Cagliari) ed ivi descritti.
Uno studio preliminare sulla attività antagonista di [Ala24]Bv8 verso gli effetti di Bv8 è riportato nel brevetto RM2007A000182. Questo peptide mostra un effetto antinocicettivo potente e di lunga durata in modelli animali di dolore infiammatorio.
Studi preliminari con i tre composti triazinici sostituiti, descritti nel modello B della unità 2 (Balboni, Cagliari) con i nomi PKC1, PKC2 e PKC3, hanno dimostrato che questi composti sono potenti antagonisti dei recettori delle prochineticine e mostrano proprietà anti-iperalgesiche nel topo con infiammazione da CFA (Adiuvante Completo di Freund) nella zampa.
Nel progetto di ricerca che ora sottoponiamo, allo scopo di caratterizzare farmacologicamente l’attività recettoriale degli antagonisti di PKR, i loro effetti sulla soglia nocicettiva di base e le loro proprietà analgesiche ed antiinfiammatorie, noi useremo cellule transfettate con recettori umani PK-R1 e PK-R2, colture primarie di neuroni di DRG di topo, ratti Sprague-Dawley, topi C57BL6, topi transgenici mancanti del recettore PK-R1 o PK-R2 (PKR1-KO e PKR2-KO) e topi transgenici mancanti delle cicloossigenasi COX-1 o COX-2 (COX1-KO o COX2-KO).
Innanzitutto, allo scopo di ottenere informazioni sulla relazione struttura-funzione, valuteremo la affinità dei nuovi composti per i recettori delle prochineticine mediante esperimenti di legame recettoriale e mobilizzazione di Ca++ intracellulare in colture di cellule CHO stabilmente transfettate con PK-R1 o PK-R2 umani ed in neuroni sensitivi primari di DRG prelevati da topi selvaggi (WT) e da topi PK-R1-KO e PK-R2-KO. L’affinità relativa dei composti per i recettori PK-R1 o PK-R2 sarà valutata con costante di inibizione ottenuta da curve di spiazzamento del legame MIT-I 125/recettore nelle suddette colture cellulari. MIT è un analogo di Bv8/Prokineticine, presente nel veleno del serpente Black Mamba, che possiede altissima affinità (pmol) per i recettori delle prochineticine e, marcato con iodio 125 (Perkin Elmer, USA) è il miglior radioligando per i PKRs ad oggi disponibile (Negri et al, 2005; ref 13). Dagli studi di binding recettoriale ci aspettiamo di ottenere le informazioni sulla affinità e selettività per I recettori umani e murini, che guideranno la Unità 2 (Balboni, Cagliari) nella scelta delle sostituzioni da apportare alla struttura chimica di base dei loro modelli di antagonisti non-peptidici. Per valutare l’effetto antagonista dei composti è però necessario misurare nelle cellule tranfettate con PKRs e nei neuroni di DRG anche la inattivazione del recettore stimolato da opportuno agonista mediante la misura dei livelli di Ca++ intracellulare ottenuta con indicatori fluorescenti di Ca++. Quando cellule contenti i recettori PKRs sono caricate con indicatori di Ca++ (Fluo-4 AM), la loro successiva esposizione ad un agonista (Bv8 o PKs) evoca emissione di fluorescenza intracellulare che indica un aumento transitorio del Ca++ libero nel citoplasma, dovuto alla attivazione dei PKRs. Il pre-trattamento con antagonisti dei recettori delle prochineticine abolirà la risposta fluorescente all’agonista. Il grado di quenching della fluorescenza è logaritmicamente correlato alla concentrazione di antagonista. La potenza degli antagonisti sarà indicata da IC50 che verrà valutato per ogni nuova molecola. La stessa tecnica applicata a colture di DRG prelevati da topi PK-R1-KO e PK-R2-KO permetterà di valutare affinità e selettività degli antagonisti per i recettori naturalmente presenti sui nocicettori e quindi predire l’effetto antinocicettivo del farmaco “in vivo”. Inoltre, poiché i PK-R1 sono presenti solo al di fuori del SNC mentre i PK-R2 sono presenti nel SNC ed in periferia, la selettività recettoriale delle nuove molecole ci permetterà di predirne il sito di azione “in vivo”.
Le molecole con attività antagonista selezionate dai risultati delle prove “in vitro”, saranno successivamente testate in animali di laboratorio per valutarne l’ attività farmacologica “in vivo”.
Valuteremo la capacità delle nuove molecole di antagonizzare l’effetto iperalgesico di Bv8 in topi selvaggi ed in topi PK-R1- e PK-R2-KO. Questo studio è l’equivalente”in vivo” del saggio di attivazione e antagonismo recettoriale in vitro sulla mobilizzazione del calcio intracellulare. La delezione genica dei PKR ci permetterà di stabilire la selettività recettoriale degli antagonisti “in vivo” e di confermare o smentire la selettività recettoriale dimostrata “in vitro”. Non è insolito, infatti, che processi metabolici in vivo possano annullare o, meno frequentemente, indurre una selettività recettoriale in contrasto con i dati ottenuti in vitro.
I composti capaci di antagonizzare l’effetto iperalgesico di Bv8, saranno poi utilizzati per evidenziare il ruolo fisiologico di ciascun recettore PKR nella nocicezione acuta e saranno saggiati in topi e ratti portatori di lesioni croniche infiammatorie e neuropatiche per valutarne la efficacia come antiiperalgesici ed antiinfiammatori.
Sebbene i dati sperimentali disponibili indichino un ruolo funzionale di PKR e PK2 nella nocicezione e nella elaborazione della sensazione dolorosa (Negri et al., ref. 1. 2; Hu et al., ref. 17) essi si riferiscono a difetti di risposte nocicettive ottenute in topi privi di un gene PKR o del gene PK2. E’ noto che la cancellazione embrionale di un gene può generare sovra-espressione compensatoria di altri geni durante la vita embrionale e post-natale. Inoltre la cancellazione embrionale di un gene recettoriale non permette di valutare la cosidetta attività intrinseca del recettore nell’animale adulto poichè il recettore è irreversibilmente perso. Ci sono molti esempi di modifiche funzionali osservate in topi privati geneticamente di un recettore che non sono stati replicati nel topo intatto con la somministrazione di antagonisti di quel recettore. In aggiunta non è stato possibile fino ad oggi realizzare il doppio knockout dei due recettori delle prochineticine nel medesimo topo, per cui è difficile valutare il livello di partecipazione di ciascun recettore ad una risposta nocicettiva. Infine, a causa dei molti difetti morfologici presenti nel SNC e in organi periferici dei topi PK-R2-KO (Prosser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104, 648-653) il ruolo nocicettivo del recettore PK-R2 non è ben definibile in questi animali.
Noi pertanto pensiamo di programmare l’uso dei nostri antagonisti in topi selvaggi e in topi PK-R1-KO e PK-R2-KO al fine di delucidare meglio il ruolo funzionale di PKR nella nocicezione acuta. Per studiare l’influenza di ciascun PKR sul settaggio della soglia nocicettiva di base ci proponiamo di studiare le risposte nocicettive a numerosi e differenti stimoli nocivi (come dolore da calore radiante, da calore di contatto, da calore umido, da freddo, da pressione meccanica, da puntura, da acido intraperitoneale) in topi con differenti combinazioni di delezione di un gene PKR e di iniezione di un antagonista selettivo. I test farmacologici di valutazione delle risposte nocicettive in questi animali saranno quelli già da noi descritti per topi selvaggi e topi knockout (Negri et al., ref. 1, 2, 8).
Un potenziale ostacolo allo sviluppo di approcci terapeutici innovativi per il controllo del dolore è l’uso di modelli animali che sono stati validati per farmaci prototipi di una categoria (es. morfina o FANS) perché fatalmente limiteranno la selezione dei nuovi composti a candidati che abbiano profili farmacologici simili al prototipo. Per evitare interazioni con il sistema oppioide endogeno e con la produzione di prostaglandine saggeremo gli antagonisti delle PKs in modelli di dolore in animali in cui il sistema oppioide endogeno è stato inibito per mezzo di antagonisti degli oppioidi e la biosintesi delle prostaglandine è stata bloccata dalla delezione dei geni codificanti per COX-1 o COX-2. Produrremo modelli di dolore cronico infiammatorio e neuropatico in topi C57BL6 in presenza o assenza di naloxone. Poiché i topi mancanti dei geni che codificano per le COX mostrano normali risposte infiammatorie in svariati modelli di dolore (Wall and Melzack, Textbook of Pain, 5th editino, pag 462) replicheremo gli stessi modelli in topi COX1- e COX2-KO. Gli stessi modelli di dolore cronico saranno impiantati anche in topi PKR1- e PKR2-KO per accertare la eventuale selettività recettoriale dell’effetto antinocicettivo e antiinfiammatorio degli antagonisti e spiegare la precedente osservazione (Negri et al., 2006; ref .2) che la cancellazione genica di un recettore delle PKs non contribuisce allo stesso modo alla modulazione di tutte le forme di risposta nocicettiva nello stesso modello di dolore.
Nel topo useremo i seguenti modelli di dolore cronico:
a) come modello di infiammazione cronica, la infiammazione di una delle due zampe posteriori prodotta dalla iniezione intraplantare di adiuvante completo di Freund (CFA) (Iadarola et al., Pain, 45, 316-326, 1988). In questo modello edema ed iperalgesia raggiungono il massimo entro 12-24 ore. Successivamente la iperalgesia regredisce in circa 72 ore, mentre l’edema perdura più a lungo.
b) come modello di dolore neuropatico, la legatura lassa del nervo sciatico secondo Bennet et al. (Pain, 33, 87-107, 1988). Iperalgesia ed allodinia si sviluppano in 3-4 giorni e durano oltre 15 giorni.
L’ attività antiiperalgesica degli antagonisti di PKR nei sopra elencati modelli sarà valutata con i seguenti test:
1) test di retrazione della zampa da uno stimolo nocivo di natura termica – calore radiante - applicato sulla regione plantare delle due zampe posteriori (Hargreaves test o plantar test, Hargreaves et al., Pain, 32, 77-88, 1988).
2) Soglia di sensibilità ad uno stimolo tattile misurata con i filamenti di von Frey (Chaplan et al., J. Neurosi. Methods, 53, 55-63, 1994)
3) test di retrazione della zampa o della coda da un bagno di acqua calda (48°C) in cui vengono immerse.
Il grado di edema, prodotto dalla iniezione di CFA, sarà valutato confrontando il volume della zampa infiammata con il volume della zampa controlaterale sana, misurato con metodo pletismometrico.
Poiché, in un precedente studio (Negri et al., 2006, ref. 2), abbiamo dimostrato che nei topi PKR1-KO la infiammazione induce un incremento di PK2-mRNA, PK-R1 mRNA e di PK-R2-mRNA significativamente inferiore che nei topi selvaggi con lo stesso modello di infiammazione, noi studieremo l’effetto degli antagonisti di PKR sulla sovra-espressione infiammatoria di PKR e PK2. Raccoglieremo e separeremo mediante FACS le cellule infiammatorie infiltranti (prevalentemente granulociti e macrofagi) dalla zampa del topo infiammata con CFA (a diversi tempi dalla iniezione di CFA: 6h, 12h, 24 h, 48 h, 3 g, 6 g 15 g, 30 g) per estrarne mRNA totale. Quindi determineremo mediante RT-PCR la espressione di PKs e PKRs in ogni specie cellulare raccolta ai diversi tempi stabiliti dal protocollo sperimentale.
Anche nel ratto, come già descritto per il topo, valuteremo la attività anti-iperalgesica ed anti-infiammatoria degli antagonisti di PKR in presenza ed assenza di antagonisti oppioidi nei seguenti modelli di dolore:
a) iniezione intra-articolare di monoiodoacetato (MIA) in un ginocchio del ratto per indurre un quadro istopatologico simile alla osteoartrite umana (Combe et al., Neurosci. Lettera, 370, 236-240, 2004)
b) iniezione intra-articolare di CFA in un ginocchio del ratto per indurre un quadro istopatologico simile alla artrite reumatoide umana (Schaible et al., Exp. Brain Res., 66, 489-499, 1987)
L’attività anti-iperalgesica degli antagonisti di PKR sarà studiata con i seguenti test:
1) “Incapacitance test” che misura la distribuzione asimmetrica del peso corporeo sulle due zampe posteriori del ratto. Se una zampa è dolorante, l’animale sposterà il peso del proprio corpo prevalentemente sulla zampa sana. La differenza di peso caricato a destra e a sinistra misura l’asimmetria dovuta al dolore infiammatorio. (Chessel et al., Pain, 114, 386-396,2005).
2) La diminuzione della soglia nocicettiva tattile (allodinia) allo stimolo dei filamenti di vonFrey
Il grado della infiammazione sarà valutato comparando la circonferenza dell’articolazione infiammata con quella dell’articolazione sana e mediante esame istologico del danno osseo e cartilagineo.
Inoltre, poiché il danno osseo focale indotto da MIA causa neuropatia che a sua volta induce l’espressione di Activating Transcription Factor 3 (ATF-3) nei gangli dorsali L4-L5 ipsilaterali (Ivanavicious et al., Pain, 128, 272-282, 2007), misureremo ATF-3 mediante immunofluorescenza, come marker di danno del nervo.
I composti in studio saranno somministrati agli animali per via endovenosa e/o sottocutanea e successivamente anche per via orale.
Una volta selezionati e validati, si sceglierà uno fra gli antagonisti che sarà marcato dalla unità 2 (Balboni, Cagliari) con un marker fluorescente e/o radioattivo (trizio). L’antagonista marcato sarà usato dalla nostra unità per la localizzazione istologica dei recettori delle prochineticine nei DRG, nel SNC e nelle cellule infiammatorie separate mediante FACS dalla zampa infiammata.
Se otterremo ligandi ad alta affinità e selettività per PK-R1 e/o PK-R2 studieremo la localizzazione tissutale delle proteine recettoriali nel SNC, nei DRG, nel midollo osseo, negli organi linfoidi, nelle cellule del sangue ed in cellule infiammatorie. Una immafine recettoriale a media-alta risoluzione ottenuta con legame “in situ” selettivo dell’antagonista al recettore potrebbe essere di grande utilità per superare il problema (ad oggi non ancora risolto) della mancanza di anticorpi che possano efficacemente e selettivamente riconoscere i due diversi recettori delle prochineticine.