RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

ANTAGONISTI DEI RECETTORI DI BV8/PROCHINETICINE: MODELLI PER NUOVI FARMACI ANALGESICI, ANTIINFIAMMATORI ED IMMUNOMODULATORI

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - FARMACOLOGIA, CHEMIOTERAPIA E TOSSICOLOGIA MEDICA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Paola Sacerdote

Descrizione

Negli ultimi anni sono state identificate molte funzioni biologiche della famiglia delle PK (1). Bersaglio importanti per le PK sembrano essere le cellule del sistema immunitario (2). Studi del nostro gruppo hanno dimostrato che Bv8 è un nuovo immunomodulatore (1,3,4). La proteina induce un fenotipo macrofagico di tipo infiammatorio, in quanto attiva la cellula, promuovendone la migrazione e la produzione delle citochine proinfiammatorie IL-1, TNF e IL-12, mentre diminuisce la citochina antinfiammatoria IL-10. Abbiamo anche dimostrato che Bv8 modifica la funzionalità dei linfociti T, in quanto influenza l’equilibrio tra linfociti T helper (Th) 1, coinvolti nell’immunità cellulo-mediata e nell’infiammazione, e Th2, alla base delle risposte umorali e allergiche (5,6). La somministrazione di Bv8 in vivo ed in vitro determina uno spostamento dell’equilibrio Th1/Th2 verso Th1 (1,4).L’alto livello di espressione di Bv8/PK nel midollo ematopoietico, negli organi linfoidi e nei leucociti e la presenza di PKR1 e PKR2 su queste cellule suggeriscono che le PK abbiano un ruolo fisiologioco nella infiammazione e nella immunomodulazione. Considerando che un’ alterazione della omeostasi immunitaria è alla base di numerose patologie quali l’infiammazione cronica e l’ autoimmunità, le proteine della famiglia PK si possono indicare come bersaglio per lo sviluppo di nuove molecole terapeutiche. Sulla base di queste considerazioni gli obiettivi sono:
1 la caratterizzazione del profilo farmacologico di diversi analoghi, di natura peptidica e non peptidica, delle PK, forniti dalle Unità Negri e Balboni, sulle funzioni macrofagiche e dei linfociti T in vivo ed in vitro:identificazione di agonisti, agonisti parziali ed antagonisti per PKR.
2 utilizzo dei potenziali antagonisti dei PKR per modulare patologie con una importante componente immunitaria, caratterizzata dalla presenza di uno stato infiammatorio cronico. Utilizzeremo: a) il modello murino di encefalite autoimmune sperimentale (EAE) che è accettato come modello di sclerosi multipla e b) modelli di infiammazione caratterizzati dalla presenza di dolore.
1)Sia la Unità Negri sia la Unità Balboni stanno sintetizzando differenti molecole peptidiche e non peptidiche che possono interagire con il recettore delle PK secondo diverse modalità.Nella prima parte del nostro studio effettueremo uno screening di queste molecole,valutandone la capacità di modulare alcune funzioni immuni. Gli analoghi saranno utilizzati sia da soli,sia assieme al potente agonista Bv8, i cui effetti sono già ben noti, per caratterizzarne l’attività farmacologia come antagonisti. Tutti i composti saranno aggiunti in vitro o somministrati in vivo a topi, seguendo protocolli e metodiche precedentemente validate e pubblicate (1,6). Grazie agli studi già da noi condotti (1,6), sappiamo che sia il macrofago sia il linfocita T sono bersagli delle PK.
Studi sui macrofagi: verranno utilizzati macrofagi peritoneali di topo.La purezza delle preparazioni è sempre valutata in citofluorimetria con marcatori opportuni ( 7) Verranno considerate numerose funzioni macrofagiche come la chemiotassi e la produzione di citochine. Il reclutamento dei macrofagi e dei monociti ai siti di infiammazione, lesione e infezione è un vento cruciale per le risposte infiammatorie e per la immunità antimicrobica. L’abilità di migrare verso un chemioattrattivo è un evento precoce importante nella fisiologia del macrofago. Bv8 promuove una notevole migrazione a concentrazioni molto basse, nell’ordine pmolare (3). La capacità dei diversi antagonisti PK di promuovere o inibire la migrazione sarà valutata utilizzando una camera di Boyden a 48 pozzetti, e filtri di policarbonato di 5 ?.Le cellule sono poste nel compartimento superiore e le sostanze da testare, in un ampio range di concentrazioni, in quello inferiore della camera. Come controllo si utilizza il chemioattrattivo fMLP. Le cellule migrate vengono poi colorate e quantificate al microscopio (3,7). I macrofagi producono e rilasciano importanti citochine coinvolte sia nell’immunità innata sia acquisita. Per la valutazione della produzione e del rilascio di citochine i macrofagi sono messi in coltura con o senza lipopolisaccaride per indurne la attivazione. Bv8 e tutti i ligandi del recettore PKR sono aggiunti alla coltura. A tempi differenti dopo la stimolazione, i medium sono raccolti per la valutazione delle citochine secrete, e le cellule utilizzate per valutarne l’espressione. Le forme mature delle citochine proinfiammatorie IL-1, TNF, IL-6 IL-12 e la antinfiammatoria IL-10 rilasciate nel medium si misurano con degli ELISA specifici (3,6).La quantificazione dell’espressione delle citochine avviene attraverso una real-time-RT-PCR. L’RNA totale è purificato con Trizol, ed è poi trattato con DNAse per evitare la amplificazione di eventuale DNA genomico. L’RNA viene retrotrascritto in cDNA utilizzando l’enzima M-MLV RT. Il cDNA è sottoposto alla PCR quantitativa in un apparecchio ABI PRISM 7000. Per la TacMan PCR si usa una TaqMan Universal Master mix. Sono impiegati probe/primers specifici per citochine di topo ottenuti come “Assay on demand” dalla Applied Biosystem. Come gene di controllo si utilizza la GAPDH di topo. Il numero di cicli soglia e l’elaborazione dati si avvale dell’utilizzo del sistema ABI PRISM 7000 (7).
Negli studi in vivo, gli analoghi di Bv8 sono somministrati per via sottocutanea ai topi, si ottengono i macrofagi che sono poi stimolati per la produzione delle citochine come appena descritto.
Studi con i linfociti T. Normalmente per una corretta omeostasi del sistema immunitario è necessaria la presenza di un equilibrio tra i Th1 e i Th2. Noi abbiamo osservato in precedenza che la somministrazione di Bv8 causa una diminuzione della produzione delle citochine Th2 (4, Franchi, in preparazione ). Ci proponiamo di valutare questo equilibrio con la produzione di citochine rappresentative dei 2 subsets (6) dopo aggiunta in vitro e somministrazione in vivo degli analoghi di Bv8. L’attivazione dei T helper si ottiene attraverso l’immunizzazione dei topi con l’antigene proteico KLH. Ai topi si iniettano 100 ?g di KLH per via intraperitoneale; 14 giorni dopo l’immunizzazione si prelevano le milze e gli splenociti sono ristimolati in vitro con KLH(80?g) per attivare i cloni specifici di T. Negli esperimenti in vitro tutti gli analoghi sono aggiunti alla colture da soli o con l’agonista attivo Bv8. Negli esperimenti in vivo, per determinare con quale evento il sistema delle PK possa interferire,i ligandi del PKR sono somministrati in momenti diversi: insieme a KLH al momento dell’immunizazione, per identificare un eventuale effetto precoce sulla presentazione dell’antigene, o 14 giorni dopo l’immunizzazione, 4 ore prima della ristimolazione in vitro, per determinare l’effetto sugli eventi finali (6). Nei medium di coltura verranno dosate le citochine con ELISA, e nei macrofagi la loro espressione con Real-time-PCR come riportato sopra.
2)2A: EAE La encefalite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla, caratterizzato dalla presenza di una infiammazione permanente del sistema nervoso centrale causata da una demielinizzazione immuno-mediata dovuta alla presenza di Th1 autoreattivi verso gli antigeni della mielina (8). Dal momento che Bv8 è in grado di spostare l’equilibrio Th1/Th2 verso Th1, riteniamo che questo possa essere un modello adeguato per studiare in vivo il ruolo delle PK nelle patologie immunitarie: si potrebbe ipotizzare che antagonisti del PKR siano utili in questa condizione. La EAE sarà quindi utilizzata per valutare l’effetto delle molecole che nella prima parte dello studio si sono rivelate le più promettenti nell’antagonizzare gli effetti delle PK. Una EAE cronica viene indotta in topi C57Bl/6 attraverso l’immunizzazione con la glicoproteina mielinica degli oligodendrociti (MOG 35-55)in adiuvante di Freund incompleto addizionato di 8mg/ml di Mycobacterium Tubercolosis (strain H37RA). Per la sua localizzazione sulla parte più esterna della guaina mielinica il MOG è uno degli autoantigeni della SM. Ai topi si inietta inoltre la tossina della pertosse il giorno della immunizzazione e 2 giorni più tardi. Lo sviluppo clinico della patologia si valuta attraverso un monitoraggio del peso corporeo, ed utilizzando dei punteggi clinici ( 0= animale sano; 1= coda flaccida;2=atassia o paresi delle zampe posteriori; 3= paresi delle zampe anteriori e posteriori e/o di quelle anteriori; 4 : tetraplegia;5= animale moribondo o morto). Questi segni sono controllati giornalmente dall’immunizzazione. In questo modello l’insorgenza della patologia si ha attorno al 14 giorno, e i segni clinici raggiungono la massima gravità al 21 giorno, rimanendo poi costantemente elevati. Le molecole ad attività antagonista sono somministrate sia per via sottocutanea sia per via endovenosa in momenti diversi dall’induzione della patologia. 1)al momento della immunizzazione; 2) 7 o 14 giorni dopo l’immunizzazione;3)dal momento dell’immunizzazione a giorni alterni per tutta la durata della patologia. I protocolli sono stati scelti in base a quanto riportato in letteratura con questo modello e sulla base della nostra esperienza precedente in modelli di EAE (8,9). Inoltre, per controllare se un eventuale effetto degli antagonisti di PK è mediato dai loro effetti sulle citochine Th1/Th2,ne verrà valutata la produzione da parte di macrofagi e linfociti ottenuti da linfonodi e milze di animali con EAE. L’espressione delle citochine viene valutata con metodi real-time PCR come prima descritto.
2B- La abilità del sistema PK si modulare le citochine può avere un ruolo anche nelle ben note proprietà iperalgesiche riconosciute a questa famiglia. Quando viene iniettato per via endovenosa o intraplantare nel roditore, Bv8 induce una intensa sensitizzazione nocicettiva agli stimoli meccanici e termici (vedi Unità 1) (1,10). Recentemente è stato dimostrato che le citochine IL-1 e TNF sono coinvolte nella creazione di uno stato di iperecittabilità neuronale che porta allo sviluppo di una iperalgesia persistente; Il nostro e altri gruppi hanno ben caratterizzato la produzione di citochine da parte delle cellule di Scwhann dei nervi, della glia dei gangli delle radici dorsali (DRG) e del midollo spinale e da parte delle cellule immunitarie infiltranti in condizioni di dolore infiammatorio e di dolore neuropatico. (11,12,16,14,15,16,17). L’ attivazione gliale e la produzione di citochine nel tessuto nervoso sono alla base di fenomeni che portano alla cronicizzazione del dolore acuto, inducendo un dolore patologico persistente. Considerando che l’Unità 1 ha dimostrato un’ aumentata espressione delle PK e dei PKR nel tessuto infiammato, noi ci proponiamo di verificare se l’attivazione del sistema PK sia coinvolto nella upregolazione delle citochine che è presente nei DRG e nel midollo spinale durante l’iperalgesia infiammatoria. Verranno utilizzati gli stessi modelli di infiammazione e dolore infiammatorio utilizzati dalla Unità di Roma. I topi verranno trattati sia localmente (iniezione intraplantare) sia per via sistemica con le molecole identificate nella prima parte dl nostro studio come possibili antagonisti dei PKR. Ai tempi opportuni, appena prima dello sviluppo della iperalgesia e quando questa è massimale, i DRG L2-L5 ipsilaterali e controlaterali alla zampa infiammata e il midollo spinale L-2L5, (le aree che ricevono le afferente nocicettive dalla zampa) vengono prelevate mediante l’utilizzo di un microscopio. La real time PCR per la valutazione dell’espressione delle citochine viene eseguita come prima descritto e secondo procedure già da noi validate (13). L’eventuale capacità degli antagonisti del PKR di prevenire o ridurre l’espressione delle citochine nei nervi, nei DRG e nel midollo verrà correlata con la loro attività come agenti antiperalgesici studiata dalle Unità di Roma e di Napoli.
Gli obbiettivi finali di questo progetto sono:
1. capire meglio il ruolo del sistema PK nella modulazione del sistema immunitario
2.lo sviluppo di nuove molecole che avendo come bersaglio I PKR possano avere un ruolo nel trattamento di patologie caratterizzate da una componente immunitaria come gli stati di infiammazione cronica e le malattie autoimmuni. Questo aspetto è particolarmente rilevante considerando che sino ad oggi non esistono terapie veramente efficaci per patologie autoimmuni come la sclerosi multipla. Inoltre poiché l’attivazione della glia del midollo spinale e del DRG e la loro produzione di citochine è importante per la cronicizzazione del dolore, la possibilità di colpire il sistema PK potrebbe essere importante per impedire il passaggio dal dolore acuto a quello patologico persistente.

1 Negri L., et al., (2007) Bv/8 prokineticin proteins and their receptors Life Sci. 81, 1103-1116
2 Le Couter J., et al., (2004). Bv8 and endocrine gland derived vascular endothelial growth factor stimulate hematopoiesis and hematopoietic cell mobilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 101,16813-16818.
3 Martucci, C., et al., (2006). Bv8, the amphibian homologue of the mammalian prokineticins, induced a proinflammatory phenotype of mouse macrophages. Br. J. Pharmacol. 147, 225-234
4 Sacerdote, P.(2005) Bv8 induces a proinflammatory phenotype of mouse macrophages and reduces t-helper 2 cytokine production in vivo and in vitro. National congress of the italian society of neuroscience and joint italian-swedish neuroscience meeting, Ischia,
5. Mosman, T.R.& Sad, S. (1996). The expanding universe of t-cell subsets; th1,th2 and more. Immunol. Today 17, 138-146.
6 Sacerdote, P., et al., (2000). The opioid antagonist naloxone induces a shift from type 1 cytokine pattern to type 2 cytokine pattern in balb/cj mice. Blood 95, 2031-2036.
7 Martucci C. et al.,(2007) Differential involvement of relb in morphine-induced modulation of chemotaxis NO and cytokine production in murine macrophages and lymphocytes. J. Leuk. Biol., 81:344-354.,
8 Pluchino S., et al., (2003) Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis Nature, 422: 688-694
9Panerai, AE et al., Beta-endorphin concentrations in brain areas and peritoneal macrophages in rats susceptible and resistant to experimental allergic encephalomyielitis(eae).a possible relation between tnf alpha and opioids in the disease. J..Neuroimmunol. 51:169-176 1994
10 Negri L., et al., (2006) Impaired nociception and inflammatory pain sensationin mice lacking PKR1 J Neurosci 26,6716-6727
11 Watkins, L.R & Maier, S.F. (2002) beyond neurons: evidence that immune and glial cells contribute to pathological pain states. Physiol. Rev. 82, 981-1011
12 Watkins, L.R. & Maier, S.F. (1999) implications of immune-to-brain communication for sickness and pain. Proc Natl Acad Sci Usa 96, 7710-7713
13 Martucci C., et al.,(2007) The purinergic antagonist PPADS reduces pain related behaviours and interleukin-1 beta, interleukin-6, iNOS and nNOS overproduction in central and peripheral nervous system after peripheral neuropathy in mice. Pain doi:10.1016/j.pain.2007.08.017
14 Bianchi M., et al.,(2004) Increased substance p and tumor necrosis factor alpha in the paws following formalin injection in rat tail. Brain Res.1019: 255-258
15 Bianchi, M., et al., (2007) Increased tumor necrosis factor-? and PGE2 concentrations in the CSF of rats with inflammatory hyperalgesia: effects of analgesic drugs.Anest. Anal. 104: 949-954
16 Bianchi M., et al.,(2007) Effects of the bisphosphonate ibandronate on hyperalgesia, Substance P, and cytokine levels in a rat model of persistent inflammatory pain Eur. J. Pain,,doi:10.1016/j.ejpain.2007.06.005
17 Bianchi M.,et al., (2007) Effects of nimesulide on pain and on synovial fluid concentrations of substance p,interleukin-6 and interleukin-8 in patients with knee osteoarthritis: comparison with celelcoxib. Int J.Clin. Pract. 61:1270-7