RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - NEUROSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Emilio Carbone

Descrizione

Lo scopo di questo progetto è quello di ottenere precise informazioni sul ruolo che i canali L e T svolgono nella genesi dei potenziali d’azione, nell’attività pace-maker e nella neurosecrezione in cellule ippocampali e cromaffini mantenute in condizioni fisiologiche o durante l’applicazione di fattori neurotrofici, modulatori endogeni, condizioni ipossiche, canalopatie e in topi KO per i canali L (Cav1.2, Cav1.3) e T (Cav3.1 e Cav3.2). Allo scopo, useremo cinque diversi tipi di registrazioni elettrofisiologiche disponibili presso il nostro laboratorio: voltage-clamp, current-clamp, cambi di capacità, misure amperometriche e arrays di multielettrodi (MEA) per ottenere informazioni sui potenziali di membrana e correnti ioniche, rilascio di neurotrasmettitori, secrezione di singole vescicole e attività spontanea in singoli neuroni ippocampali, reti neuronali complesse e cellule cromaffini isolate. In parallelo, verrà quantizzato l’mRNA associato ai vari tipi di canali del Ca con tecniche di RT-PCR su singola cellula o da popolazioni di cellule. La separazione farmacologica delle correnti di tipo L e T e dei relativi segnali secretori sarà fatta utilizzando tossine che bloccano selettivamente i canali N e P/Q.


Obiettivo #1 – Ruolo dei canali L nell’attività pace-maker e rilascio di neurotrasmettitore in neuroni ippocampali e cellule cromaffini in condizioni fisiologiche normali o alterate.
In questo progetto studieremo il ruolo specifico che i canali L (Cav1) svolgono nella generazione dei singoli potenziali d’azione e delle loro oscillazioni spontanee in condizioni fisiologiche normali o alterate. Le cellule cromaffini e i neuroni ippocampali di ratto esprimono alte densità di canali L ma poco si conosce dei contributi che le due isoforme esercitano (Cav1.2 and Cav1.3) nell’attività dei neuroni centrali. Dato che la subunità Cav1.3 si attiva a potenziali relativamente bassi (-50, -40 mV in 2 mM Ca) vi sono evidenze che questa isoforma funzioni da pace-maker in neuroni centrali e cellule cromaffini (Marcantoni et al., 2007a,b). Alla luce di ciò, è interessante verificare se anche i neuroni ippocampali di topo esprimono questo tipo di canali e se questi svolgono una funzione pace-maker nella generazione di attività spontanea sia in condizioni fisiologiche normali sia dopo un’up-regolazione indotta da fattori esterni. Al momento esistono due modi per up-regolare il numero di canali L funzionali. Uno richiede l’uso dell’NGF che recluta selettivamente i canali L in neuroni ippocampali embrionali (Baldelli et al., 2002), l’altro sfrutta la possibilità che l’ipossia cronica (CH) (12 ore al 3% di PO2) up-regoli i canali di tipo L (nativi e ricombinanti) in alcuni tipi di cellule (PC12, HEK-293 stabilmente trasfettate con Cav1.2, granuli cerebellari). Nel caso dell’ipossia cronica l’up-regolazione dei canali L è associata alla presenza della proteina ? amiloide (A?P) che forma un complesso stabile con il canale L e aumenta i flussi di Ca attraverso la membrana neuronale. E’ interessante notare che un prolungato stato ipossico (cronico o intermittente) è clinicamente associato ad un aumentato grado di demenza senile che è la più comune forma di malattia di Alzheimer e ciò può essere associato all’ingresso di Ca attraverso il complesso A?P/canale L che si forma durante periodi di ipossia.
L’obiettivo principale di questo progetto è lo studio degli effetti dell’NGF e dell’ipossia cronica sulle proprietà elettrofisiologiche di neuroni ippocampali di topo. Gli esperimenti saranno condotti con la tecnica del patch-clamp per quantificare la densità e funzionalità delle isoforme dei canali L in neuroni normali, trattati con NGF e dopo ipossia cronica. Useremo anche registrazioni con i MEA (multi-electrode array) per misurare la forma e la frequenza dei potenziali d’azione neuronali. Siccome non sono disponibili sostanze capaci di bloccare selettivamente i canali Cav1.2 e Cav1.3, per prima cosa verificheremo l’esistenza di un generale reclutamento di canali L e identificheremo il canale principalmente up-regolato con l’RT-PCR quantitativa. In funzione di questi dati preliminari, verificheremo se l’up-regolazione è presente nei neuroni dei topi KO Cav1.2 e Cav1.3 che ci sono stati forniti dal network europeo CavNET (http://www.cav-net.org/). Il reclutamento selettivo dei canali L indotto da NGF e ipossia cronica sarà usato anche per testare il contributo di Cav1.2 e Cav1.3 nel rilascio di neurotrasmettitore studiando l’attività sinaptica delle sinapsi GABAergiche e glutammatergiche usando: 1) treni di potenziali d’azione come stimoli, 2) alterazioni specifiche della forma del potenziale d’azione (allargamento indotto da TEA o qualsiasi altro bloccante dei canali del K) e 3) agonsti dei canali L (Bay K 8644) o antagonisti (nifedipina) per potenziare o bloccare l’influsso di Ca attraverso i canali L.

Studieremo inoltre il ruolo svolto dai canali L nell’attività pace-maker e nel rilascio ormonale in cellule cromaffini di topo che esprimono alte densità di canali L e possiedono entrambi le isoforme Cav1.2 e Cav1.3 (Baldelli et al., 2004). Esperimenti preliminari nel nostro laboratorio hanno mostrato che i canali L delle cellule cromaffini di ratto si attivano a potenziali relativamente bassi (-50, -40 mV in 2 mM Ca), controllano buona parte della secrezione di catecolamine e sono fortemente accoppiati ai canali del K Ca-dipendenti (Marcantoni et al. 2007b). Pertanto questi canali possiedono le caratteristiche essenziali per sostenere una corrente entrante di ioni Ca capace di depolarizzare lentamente le cellule a riposo e di indurre depolarizzazioni ripetute. In questo progetto testeremo inoltre se la corrente entrante di Ca disponibile a potenziali di riposo, e che da origine ai potenziali d’azione veloci, è principlamente trasportata dalle isoforme Cav1.2 o Cav1.3 in topi WT e KO. Misureremo anche simultaneamente correnti di Ca e secrezione usando variazioni di capacitanza e misure amperometriche associate alla fusione di vescicole e rilascio di catecolamine, per stabilire il ruolo effettivamente svolto da Cav1.2 e Cav1.3 nel controllo dell’esocitosi.


Obiettivo #2 – Esistenza di percorsi modulatori mediati da agonisti convergenti su un unico canale o su due canali L neuronali distinti
Recentemente, abbiamo dimostrato che i canali L delle cellule cromaffini di ratto sono soggetti a due tipi diversi di modulazione: una veloce inibizione mediata da proteine Gi accoppiate a recettori di membrana (che si sviluppa in secondi) e un lento potenziamento mediato dal cAMP (che richiede minuti). I due meccanismi possono presentarsi sovrapposti o isolati (Cesetti et al., 2003). L’inibizione veloce è limitata alla superficie di membrana ed è mediata da autocettori ?2-AR, oppiodergici e purinergici, mentre il potenziamento lento è mediato da recettori ?1-AR accoppiati all’adenilato ciclasi e involve un percorso intracellulare mediato da cAMP/PKA. Al momento non esistono mezzi farmacologici che permettano di verificare se i due percorsi sono dovuti a due meccanismi distinti che convergono su un unico canale o esistono due percorsi paralleli che agiscono su due canali distinti. In questo progetto vorremmo completare questo studio utilizzando topi WT e KO per Cav1.2 e Cav1.3. Se i due sistemi di modulazione (lento e veloce) agiscono separatamente su due canali distinti, usando i topi KO saremmo in grado di separarli sia a livello di registrazioni di correnti da tutta la cellula che a livello di singolo canale. In seguito, studieremo il ruolo che queste due modulazioni svolgono nel controllo dell’attività autoritmica e nel rilascio di catecolamine. Dato che i due sistemi di modulazione sono autocrini, essi possono generarsi senza l’uso di sostanze endogene ma sono molto sensibili alle condizioni di perfusione della cellula in esame come riportato in precedenza (Albillos et al,, J. Physiol. 494: 687-695, 1996). In condizioni di perfusione bloccata sono attivi mentre sono inattivi in condizioni di flusso esterno aperto.
Prevediamo di testare l’esistenza di questi due meccanismi anche in neuroni ippocampali i cui canali L sono inibiti con una cinetica veloce da un meccanismo GABAb-dipendente (Scholz & Miller, J. Physiol. 444, 669–686, 1991) ed up-regolati lentamente da un meccanismo cAMP-dipendente (Kawalali et al. J. Neurosci. 17: 5334–5348, 1997). Prevediamo anche di verificare se gli stessi percorsi sono preservati in neuroni ippocampali di topo e se sono specificamente associati ai due canali Cav1.2 and Cav1.3 neuronali.


Obiettivo # 3 – Reclutamento di canali T in neuroni ippocampali esposti a condizioni di ipossia cronica o di stress in topi WT e KO per Cav3: implicazioni nelle varie forme di epilessia.
L’obiettivo principale di questo progetto è di determinare il ruolo svolto dai canali T nella generazione dell’attività spontanea delle sinapsi GABAergiche e glutammatergiche in neuroni ippocampali e nell’attività pace-maker e di rilascio ormonale in singole cellule cromaffine di topo. Lo scopo di questo progetto nasce dall’osservazione che l’esposizione di cellule cromaffini a condizioni di ipossia cronica (12 ore a 3% PO2) o l’attivazione degli HIF (hypoxia-inducible factors) con desferrioxamina (DFX) produce un marcato reclutamento di canali Cav3.2 (Carabelli et al., 2007). Entrambe le condizioni producono una corrente inward del Ca di circa 10-20 pA che si attiva a bassi potenziali (–50 to –60 mV in 2 mM Ca) e capace di caricare la capacità di membrana di circa 10-30 mV e causare treni di potenziali d’azione spontanei con attività tonica che perdurano nel tempo.
A seguito di ciò proponiamo di verificare se il reclutamento dei canali Cav3.2 osservato nelle cellule cromaffini di ratto avviene anche in cellule cromaffini e ippocampali di topo, dato che quest’ultime già esprimono canali di tipo T allo stadio embrionale, neonatale e adulto che vengono regolarmente down-regolati durante il mantenimento in coltura (Baldelli et al., 2002). Pertanto, in questo progetto prevediamo una serie di esperimenti di patch-clamp nei quali neuroni ippocampali di topo in coltura siano mantenuti per una notte (trattamento cronico) o a periodi intermittenti (1 ora a bassa PO2 e 1 ora a PO2 normale) e verificare se singoli neuroni ippocampali esprimono sufficienti densità di canali T. Per testare il tipo di canale implicato useremo dosi crescenti di Ni. Un blocco pressoché completo con 50 microM Ni sarà indicativo per la presenza di canali Cav3.2 mentre il blocco a dosi 3-4 volte più elevate sarà indicativo della presenza di canali Cav3.1. dato che il canale Cav3.2 è implicato in molte forme di epilessia assente in modelli animali e in altre forme di epilessia indotta (Nelson et al., 2006) è possibile che anche nel caso di canali T reclutati da ipossia sia coinvolta questa isoforma. In questo caso, testeremo questa possibilità con l’RT-PCR quantitativa su singola cellula in neuroni ippocampali e utilizzando topi Cav3.2 KO che sono disponibili nel laboratorio del Prof. Hee-Sup Shin (Korea Inst. of Science & Technology, Seoul, Korea) dal quale abbiamo già ricevuto un accordo formale di utilizzo degli animali. L’implicazione di questi risultati potrebbe essere che l’up-regolazione dei canali T (Ca3.2 o Cav3.1) durante stati di ipossia cronica o intermittente potrebbe essere uno degli eventi scatenanti alcune forme di epilessia assente. Esiste infatti una vasta letteratura al proposito che mostra una stretta correlazione tra condizioni ipossiche e varie forme di epilessia (Williams et al., Epilepsia, 48:157–163, 2007) ma al momento non esistono ipotesi specifiche sul ruolo che i canali potrebbero avere in queste patologie. Capire esattamente i meccanismi molecolari che sono alla base di questi eventi permetterà di sviluppare nuovi e più selettivi farmaci da utilizzare in futuri trattamenti terapeutici.

Di particolare interesse in questo progetto è la possibilità di verificare se l’ipossia cronica o aumentati livelli di cAMP protratti nel tempo (Novara et al., 2004) siano capaci di aumentare sia l’attività spontanea di reti neuronali (aumentata frequenza di neuroni già attivi o reclutamento di attività in neuroni normalmente silenti) che l’attività sinaptica di terminali GABAergici e glutammatergici. Per studiare l’attività dei PA spontanei useremo i MEA che abbiamo recentemente acquistato con fondi del precedente progetto COFIN-MIUR (PRIN 2005) e del Centro di Eccellenza NIS (http://www.nis.unito.it/) nel quale il nostro gruppo opera. Per questo progetto utilizzeremo i programmi software disponibili presso il laboratorio del Prof. Wanke (Unità di Ricerca di Milano) con il quale già collaboriamo per l’analisi delle registrazioni con MEA. Il sistema a MEA ha il grande vantaggio di permettere registrazioni extracellulari simultaneamente da 60 neuroni senza alterare o danneggiare l’architettura della rete neuronale in esame. Questo permette di testare l’attività dei neuroni depositati sui MEA prima e durante il trattamento ipossico osservando periodicamente i cambi nei parametri elettrofisiologici associati alla forma del potenziale d’azione e il modo di generare pattern di potenziali d’azione nei neuroni in attività. A causa della bassa soglia di attivazione dei canali Cav3.1 e Cav3.2 rispetto agli altri tipi di canali del Ca, da una up-regolazione di canali T ci si aspetta un’aumentata frequenza dei potenziali d’azione e possibilmente un cambio da fasico a tonico nel modo di generare i potenziali d’azione.