RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - SCIENZE BIOMEDICHE SPERIMENTALI - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Daniela Pietrobon

Descrizione

Il nostro obiettivo è capire come il guadagno di funzione dei canali Cav2.1 prodotto dalle mutazioni FHM1 causi la malattia e i suoi sintomi tipici di aura e mal di testa, e così acquisire importanti nozioni sulla patogenesi dell’emicrania e sul suo trattamento. Usando topi FHM1 KI, che presentano una maggiore suscettibilità alla cortical spreading depression (CSD) (7), approfondiremo i meccanismi che sottendono la maggiore suscettibilità corticale alla CSD. Dato il contributo dominante dei canali Cav2.1 nel controllo del rilascio di glutammato alle sinapsi eccitatorie centrali (1), e il ruolo chiave svolto dai canali Cav2.1 (7) e dai recettori NMDA (3) nell’innesco e nella propagazione della CSD, la nostra ipotesi di lavoro è che un eccessivo rilascio di glutammato e un’ipereccitabilità della rete neuronale corticale conseguenti al guadagno di funzione del canale Cav2.1 siano alla base della facilitazione della CSD nell'FHM1. Per verificare questa ipotesi studieremo la neurotrasmissione eccitatoria e inibitoria e l’eccitabilità dei circuiti corticali in topi FHM1 KI con le mutazioni R192Q e S218L (obiettivo 1). In parallelo studieremo gli effetti delle mutazioni FHM1, di mediatori emicranici e di farmaci antiemicranici su neuroni nocicettivi del ganglio trigeminale (obiettivo 2).

Obiettivo 1 Analisi della neurotrasmissione corticale eccitatoria e inibitoria e dell’eccitabilità dei circuiti corticali in topi WT e FHM1 KI
Nei due anni finanziati dal Prin 2005 abbiamo studiato la neurotrasmissione corticale eccitatoria in topi R192Q KI tramite l’analisi delle correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) in singole cellule piramidali corticali coltivate in microisole gliali e dei potenziali postsinaptici eccitatori (EPSPs) in coppie formate da cellule piramidali connesse a interneuroni fast-spiking, in fettine talamocorticali acute. In entrambi i sistemi abbiamo trovato un aumento della efficacia della trasmissione sinaptica e della depressione a breve termine durante treni di potenziali d’azione (PA), dovuti a un aumento della probabilità di rilascio di glutammato a seguito di un maggiore influsso di calcio attraverso i canali Cav2.1 presinaptici (10; Tottene et al. manoscritto in preparazione). Abbiamo altresì dimostrato una riduzione dell’inibizione della neurotrasmissione eccitatoria da parte dei recettori GABAB in neuroni corticali in microcoltura. Questi risultati sono consistenti con la nostra ipotesi di lavoro che vede un’ipereccitabilità corticale alla base dell’aumentata suscettibilità alla CSD nell’emicrania. Per verificare più a fondo questa ipotesi è essenziale studiare la neurotrasmissione corticale inibitoria e l’eccitabilità dei circuiti corticali.

Il primo compito specifico di questa proposta è quindi lo studio della neurotrasmissione corticale inibitoria in topi WT e topi R192Q KI. Misureremo le correnti postsinaptiche inibitorie evocate (IPSC) in interneuroni corticali di topi P0-2 cresciuti in microisole gliali e formanti sinapsi su se stessi (autapsi) e, tramite la tecnica del doppio patch-clamp, IPSPs in coppie formate da diversi tipi di interneuroni connessi a cellule piramidali in fettine talamocorticali acute di topi P11-20. Se dovessimo trovare delle alterazioni, ne studieremo i meccanismi (cambiamenti nella probabilità di rilascio e/o nel pool di vescicole pronte al rilascio e/o nel quanto di neurotrasmettitore) e la possibile presenza di meccanismi omeostatici compensatori (quali cambiamenti nei canali Ca presinaptici di tipo N e/o R e/o nei recettori postinaptici). Per poter distinguere la quantità di rilascio controllato dai canali Ca di tipo P/Q, N e R, effettueremo esperimenti con bloccanti specifici dei canali Ca; per verificare direttamente la presenza di meccanismi postsinaptici di compensazione omeostatica misureremo IPSC in miniatura (mIPSC). Studieremo anche la modulazione da proteine G della neurotrasmissione inibitoria.

Il secondo compito specifico è quello di completare l’analisi della trasmissione eccitatoria in topi R192Q KI, con lo studio del recupero dalla depressione a breve termine durante treni di PA (sia in colture che in fettine) e del meccanismo della ridotta inibizione presinaptica da parte dei recettori GABAB in neuroni corticali in microisole.

L’equilibrio fra eccitazione e inibizione è determinante per il comportamento della rete nei circuiti corticali. La nostra ipotesi di lavoro è che le mutazioni di tipo FHM1 spostino questo equilibrio verso l’eccitazione durante l’attività corticale a seguito di un effetto diverso sui diversi tipi di sinapsi, e che questo sia alla base della suscettibilità all’induzione della CSD in presenza di specifici trigger e dell’anomala elaborazione dell’informazione sensoriale negli emicranici (2,4). Il terzo compito specifico è quindi quello di determinare se le mutazioni di tipo FHM1 alterino l’eccitabilità dei circuiti corticali locali e il bilancio tra inputs sinaptici eccitatori e inibitori. Misureremo quindi i) la generazione spontanea di PA in fettine acute di neocorteccia di topi P12-20 WT e R192Q KI incubate in una soluzione ACSF modificata che più si avvicina alla composizione del fluido interstiziale del cervello murino e che in neuroni piramidali da’ luogo a firing spontaneo azionato dall’attività sinaptica (13) e ii) EPSC e IPSC spontanei dovuti all’attività di rete della fettina. Se dovessimo trovare un alterato equilibrio, indagheremo il coinvolgimento specifico dei canali CaV2.1 mutati e la possibile presenza di compensazioni da parte di altri canali del calcio o di altri meccanismi. Studieremo anche possibili alterazioni nel firing intrinseco dei neuroni piramidali. Per determinare se l’equilibrio fra eccitazione e inibizione sia alterato durante un’attività sostenuta, confronteremo la relativa depressione di EPSC e IPSC evocate da stimolazione extracellulare locale prolungata come in(14).

Data l’evidenza che l’induzione della CSD dipende dall’aumento della concentrazione di K+ oltre un livello critico nello spazio ristretto che circonda i neuroni corticali (3), abbiamo proposto un modello in cui l’abbassamento della soglia per l’induzione della CSD in topi FHM1 KI è dovuto al fatto che una minore concentrazione di K+ e' in grado di aprire i canali sinaptici Cav2.1 mutati e liberare glutammato in quantità sufficiente ad iniziare il feedback positivo che porta all’induzione della CSD (4). Per testare questa ipotesi, studieremo come un piccolo aumento nella concentrazione di K extracellulare (sotto e fino alla soglia per l’induzione della CSD) alteri il rilascio di neurotrasmettitore in sinapsi corticali di topi WT e KI misurando la frequenza di mEPSC e mIPSC a concentrazioni crescenti di K+.

Stiamo già studiando in dettaglio l’effetto della mutazione FHM1 sulle proprietà (efficacia e plasticità a breve termine) di connessioni unitarie eccitatorie e inibitorie fra coppie di neuroni corticali dello strato 2/3 della corteccia somatosensoriale in fettine acute di topi R192Q KI. In questo progetto (quarto compito specifico) ci concentreremo sulla connessione eccitatoria fra neuroni piramidali e interneuroni “bitufted”, una sinapsi caratterizzata da una bassa probabilità di rilascio e facilitazione a breve termine (15). Confronteremo gli effetti a questa sinapsi con quelli ottenuti nella connessione fra cellule piramidali e interneuroni fast-spiking, caratterizzata da un’alta probabilità di rilascio e depressione a breve termine. Studieremo anche la sinapsi inibitoria reciproca, che termina sui dendriti apicali nel caso degli interneuroni “bitufted” e sul soma e dendrita prossimale nel caso degli interneuroni fast-spiking. Un’attesa differenza dell’effetto della mutazione FHM1 sulla trasmissione a queste sinapsi potrebbe avere conseguenze interessanti sull’equilibrio tra gli input eccitatori e inibitori sui dendriti delle cellule piramidali (i primi a depolarizzarsi durante la CSD) ad alte frequenze di PA.

In collaborazione col Dr. Wanke, che possiede una unita' con matrici di multielettrodi (MEA) funzionante, intendiamo misurare in fettine acute di corteccia somatosensoriale di topi WT e KI il potenziale sinaptico locale e la propagazione spaziotemporale dell’eccitazione e dell’inibizione attraverso i vari strati corticali evocati da una stimulazione dello strato 4, come in (16) (quinto compito specifico). Useremo stimoli di diversa intensità, durata e forma, e studieremo l’effetto di neuromodulatori, il cui livello è probabilmente cambiato da noti trigger dell’emicrania, quali lo stress emotivo.

A differenza della mutazione FHM1 R192Q, la S218L produce un fenotipo clinico grave, in cui un lieve trauma cranico puo’ provocare attacchi tipici di emicrania emiplegica seguiti, dopo un intervallo di lucidità, da coma profondo (a volte fatale) e grave edema cerebrale (9,17). Abbiamo mostrato che, in correlazione con la gravità della malattia, il guadagno di funzione dei canali Cav2.1 e la facilitazione dell’induzione e propagazione della CSD sono maggiori nei topi S218L KI che nei R192Q (18; manoscritto in preparazione). Inoltre, in contrasto con la R192Q, la mutazione S218L produce CSD ricorrenti al valore soglia di stimolazione. Per comprendere i meccanismi corticali alla base di questa alta vulnerabilità alla CSD, condurremo in parallelo lo studio della neurotrasmissione eccitatoria e inibitoria e dell’eccitabilità della rete corticale in topi S218L KI (sesto compito specifico).


Obiettivo 2 Effetti di mutazioni FHM1, di mediatori dell'emicrania e di farmaci antiemicranici sui neuroni nocicettivi trigeminali
Nei due anni finanziati dal Prin 2005 abbiamo dimostrato che nei gangli trigeminali (TG) di topi adulti si possono identificare tre diversi tipi di nocicettori potenziali (caratterizzati da piccolo soma e PA abbastanza lunghi), distinguibili sulla base delle proprietà di firing, sensibilità alla capsaicina e espressione di canali Ca a bassa soglia di attivazione (tipo T) (12; Catacuzzeno e al. manoscritto in preparazione). Per i due tipi più abbondanti di neuroni TG (neuroni MFCS con firing ripetuto, capsaicina sensibili e privi di correnti Ca tipo T, e neuroni DMFCI-T con delay che precede il firing, capsaicina insensibili, con correnti Ca tipo T) abbiamo studiato le proprietà della corrente Ca P/Q in topi WT e R192Q KI. I neuroni MFCS e DMFCI-T (CI-T) esprimono canali P/Q funzionalmente diversi, che rappresentano rispettivamente il 40% e il 60% della corrente Ca diidropiridina-insensibile ad alta soglia di attivazione. Come precedentemente trovato in neuroni cerebellari e corticali, la densità della corrente P/Q nei neuroni CI-T da topi R192Q KI è maggiore che in topi WT in un ampio intervallo di potenziali, come conseguenza di uno spostamento della curva di attivazione verso potenziali più negativi. Al contrario, nei neuroni MFCS non si osserva nessuna differenza nella densità della corrente P/Q e nella soglia di attivazione tra topi WT e R192Q KI (12; Fioretti e al., manoscritto in preparazione).
Una possibile spiegazione di questo guadagno di funzione neurone specifico è che neuroni TG diversi esprimano diverse isoforme della subunità Cav2.1alpha1. Il primo compito specifico dell’obiettivo 2 è quello di verificare questa ipotesi con esperimenti di RT-PCR su singola cellula (in collaborazione con T. Snutch, Università della Columbia Britannica).

Mentre è noto che i neuroni TG capsaicina sensibili sono nocicettori polimodali che innervano le meningi, la natura nocicettiva e la funzione fisiologica dei neuroni CI-T non si conoscono. Dato il selettivo guadagno di funzione della mutazione FHM1 nei neuroni TG CI-T, e il nostro interesse a scoprire l'impatto delle mutazioni FHM1 sulla nocicezione trigeminovascolare, il secondo compito specifico dell’aim 2 è di stabilire se i neuroni CI-T sono in realtà nocicettori, e se essi innervano le meningi. A tal fine verificheremo nei neuroni CI-T dissociati da topi selvatici la presenza di alcuni marcatori della nocicezione, come i canali Na TTX resistenti, i canali P2X3, ASIC e TRPM8, la risposta a vari agenti infiammatori (PGE2, istamina, serotonina, bradichinina) e analgesici (DAMGO), e l’immunoreattività per il CGRP e la sostanza P; impiegheremo la tecnica della marcatura retrograda (sviluppata e utilizzata con successo dal Dr M. Connor dell’Università di Sidney) per marcare gli afferenti della dura, e indgheremo la presenza di correnti Ca tipo T e/o le proprietà di firing nei neuroni marcati.

Il terzo compito specifico è quello di stabilire se il guadagno di funzione dei canali P/Q mutati nei neuroni CI-T si traduce in alterazioni dell’eccitabilità e del rilascio di neurotrasmettitore. Per indagare possibili alterazioni dell’eccitabilità confronteremo il potenziale di riposo, la forma dell’AP e le proprietà di firing nei neuroni WT e R192Q KI.
Dato che i neuroni sensoriali primari sono in grado di comunicare con e modulare l’eccitabilità di cellule vicine mediante rilascio locale di mediatori chimici (19,20), studieremo il rilascio somatico dai neuroni CI-T di topi WT e KI utilizzando misure di capacità di membrana. Il rilascio somatico verrà evocato mediate vari stimoli depolarizzanti (compresi treni di AP registrati in precedenza da neuroni TG in condizioni fisiologiche) che, da dati preliminari, sono in grado di indurre rilascio in parte dipendente dai canali P/Q. Data l'importanza del rilascio di CGRP nella patogenesi dell’emicrania (2,4), confronteremo la capacità dei neuroni WT e KI in coltura di rilasciare CGRP in risposta a stimolazioni con alto K e/o zuppa infiammatoria, utilizzando un saggio radioimmunologico (RIA) come in (21), che è operativo nel nostro laboratorio. Per aumentare la frazione di neuroni CI-T, pretratteremo le culture con capsaicina per eliminare i neuroni capsaicina sensibili.

Il quarto compito specifico è quello di indagare se (e come) le correnti Ca dei neuroni TG sono modulate da un classico mediatore emicranico, l’NO, e da farmaci efficaci nel trattamento acuto dell’emicrania (triptani e antagonisti del CGRP), e così acquisire informazioni sul loro meccanismo d'azione. E' stato dimostrato che l’NO può stimolare il rilascio di CGRP dai neuroni TG in coltura con un meccanismo che coinvolge l'attivazione di canali Ca LVA (22), e che questi canali hanno un ruolo nella nocicezione spinale e nel rilascio di neurotrasmettitori in diverse sinapsi, comprese quelle tra gli afferenti primari e i neuroni delle corna dorsali spinali (23). Studieremo quindi l'effetto di donatori dell’NO sui canali Ca LVA in neuroni CI-T (e il loro coinvolgimento nel rilascio somatico, in collaborazione con il Dr Carbone). Visto che l’NO potenzia il canale Cav2.1 ricombinante spostando la sua curva di attivazione a potenziali più negativi (24), studieremo anche la modulazione dei canali P/Q da NO nei diversi neuroni TG. Se saranno trovati effetti interessanti, studieremo anche la modulazione del rilascio somatico da neuroni TG di topi WT e KI.
E’ sempre più evidente che il sito d’azione critico di farmaci antiemicranici efficaci (come i triptani e un nuovo antagonista del CGRP) è la neurotrasmissione centrale tra gli afferenti trigeminovascolari primari e i neuroni del nucleo caudale trigeminale (4). Studieremo l’effetto del sumatriptan e del CGRP sulle correnti Ca dei neuroni TG per verificare l’ipotesi che l'inibizione dei canali Cav indotta dall’attivazione di specifici recettori 5HT1 sui terminali centrali dei nocicettori meningei può contribuire a inibire la neurotrasmissione nel caso dei triptani, mentre la stimolazione dei canali Cav mediante attivazione degli autorecettori di CGRP può facilitare la neurotrasmissione. Caratterizzeremo le componenti farmacologiche possibilmente coinvolte, e il meccanismo della sua possibile modulazione.