RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università di riferimento

Università degli Studi di TORINO - NEUROSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Filippo Tempia

Descrizione

Da alcuni anni l’Unità di Ricerca studia vari tipi di canali del potassio e del sodio, compresi quelli responsabili del controllo dell’eccitabilità di membrana. Gli obiettivi di questo progetto sono: 1) l’individuazione di alterazioni dell’eccitabilità di membrana in modelli del morbo di Alzheimer (AD) con l’approfondimento del ruolo svolto dai canali del potassio; 2) lo studio delle alterazioni dell’eccitabilità di membrana e dei canali del potassio della sottofamiglia erg (KCNH2, KCNH6, KCNH7) nell’epilessia.

OBIETTIVO 1: ECCITABILITÀ DI MEMBRANA E CANALI DEL POTASSIO IN MODELLI DI MORBO DI ALZHEIMER
Studi precedenti hanno mostrato, in ciascun modello sperimentale di AD indagato, una specifica alterazione di una corrente del potassio che provocava una riduzione dell’eccitabilità di membrana. E’ interessante notare che il canale coinvolto era diverso in ogni modello, ma che in tutti i casi il risultato era una diminuzione dell’eccitabilità di membrana. L’unica possibile eccezione è la sovraespressione del canale Kv3.4, di cui non sono state indagate le conseguenze sul potenziale di membrana (v. Stato dell’arte). L’espressione e le proprietà biofisiche delle correnti Kv3 contenenti la subunità Kv3.4 sono state studiate dalla nostra Unità operativa nell’ambito del progetto PRIN-2005 (Sacco et al., 2006).
FASE 1.1. Per il nostro studio utilizzeremo diversi modelli di AD. In primo luogo utilizzeremo un modello in vitro della patologia, in cui studieremo le alterazioni causate dall’applicazione di oligomeri del peptide beta-amiloide, che sono attualmente ritenuti i diretti responsabili della maggioranza dei sintomi precoci. Questo modello semplificatissimo può verosimilmente fornire risultati in tempi brevi. Una validazione dei dati in vitro verrà effettuata utilizzando dei topi transgenici modello della patologia umana. Per questo approccio in vivo utilizzeremo topi transgenici in cui sono stati inseriti o due (amyloid precursor protein e presenilin 1: Radde et al., 2006) o tutti i tre (amyloid precursor protein, presenilin 1, tau: Oddo et al., 2003) principali geni implicati nell’AD. Questi topi presentano alterazioni istopatologiche e cognitive già a partire da 4-6 mesi di età, in epoca fortemente antecedente l'inizio della senescenza.
Una prima analisi sarà volta ad individuare ogni possibile alterazione della scarica di potenziali d’azione di vari tipi di neuroni coinvolti nell’AD. Data la scarsità di risultati in letteratura, in questa prima fase analizzeremo per ogni parametro tutte le possibili alterazioni indotte dalla somministrazione acuta o cronica di oligomeri del peptide beta-amiloide. In una prima serie di esperimenti, i potenziali d’azione saranno registrati come attività spontanea utilizzando la tecnica del patch-clamp in configurazione di cell-attached, che permette una registrazione extracellulare ad alta risoluzione da singola cellula. Infatti, è noto che in fettine di tessuto nervoso molti tipi di neuroni hanno un’attività intrinseca di scarica di potenziali d’azione con una determinata frequenza media. Questa analisi è facilmente applicabile sia alle fettine in cui verranno somministrati gli oligomeri di beta-amiloide, sia alle fettine dei topi transgenici che verranno confrontate con quelle dei topi di controllo. In una seconda serie di esperimenti, mediante registrazioni in configurazione di whole-cell, il potenziale di membrana verrà mantenuto sotto soglia mediante l’iniezione continua di corrente iperpolarizzante e da questa condizione verranno applicati dei gradini di corrente depolarizzante in grado di innescare una scarica evocata di potenziali d’azione. I parametri correlati all’eccitabilità di membrana che analizzeremo comprendono la latenza del primo potenziale d’azione, il voltaggio soglia, l’ampiezza e la durata del potenziale d’azione, l’ampiezza dell’iperpolarizzazione postuma, la durata del primo intervallo tra potenziali d’azione, la frequenza media di scarica, l’adattamento o l’accelerazione della frequenza di scarica, la resistenza di input, la rettificazione anomala. Anche questa analisi sarà applicata sia alle fettine in cui verranno somministrati gli oligomeri di beta-amiloide, sia alle fettine dei topi transgenici.
Le registrazioni verranno effettuate sui tipi di neuroni che sono noti essere maggiormente affetti nell’AD, come i neuroni piramidali di ippocampo, di corteccia entorinale e di neocorteccia e i neuroni colinergici dei nuclei del setto. E’ possibile che le alterazioni indotte dalla beta-amiloide siano mediate da meccanismi comuni in qualunque tipo di neurone, indipendentemente dal fatto che si trovi in una regione in cui nei pazienti si osservano placche amiloidi. Questa ipotesi verrà valutata registrando anche i neuroni di Purkinje della corteccia cerebellare, un centro nervoso relativamente risparmiato dalla patologia.
FASE 1.2. Le registrazioni della scarica spontanea ed evocata di potenziali d’azione saranno la base di partenza per indagare direttamente i meccanismi molecolari che ne sono responsabili. Quindi, l’obiettivo di questa fase è l’identificazione delle correnti ioniche e delle subunità proteiche dei canali, sensibili agli oligomeri del peptide beta-amiloide, responsabili delle alterazioni dell’eccitabilità di membrana e della scarica di potenziali d’azione. Le metodologie che verranno utilizzate sono la registrazione delle correnti ioniche putativamente implicate, la visualizzazione e la quantificazione delle proteine-canale mediante immunoistochimica, la quantificazione dell’espressione dei rispettivi geni mediante real-time RT-PCR.
La prima serie di questi esperimenti verrà compiuta su fettine di tessuto nervoso in vitro, in cui si perfonderà la beta-amiloide o si paragoneranno gli animali transgenici con i controlli. Le correnti ioniche verranno registrate con la tecnica del patch-clamp in modalità di voltage-clamp. Le correnti del potassio saranno isolate da quelle mediate da altri ioni con l’utilizzo di bloccanti specifici. Le diverse componenti delle correnti del potassio saranno ulteriormente separate utilizzando le procedure biofisiche e chimiche descritte in letteratura e in gran parte già utilizzate nel nostro laboratorio. Prevediamo di riuscire a restringere il numero di possibili canali candidati, su cui approfondire le indagini con anticorpi per immunoistochimica e sonde per real-time RT-PCR. Sarà prestata particolare attenzione ai canali che studi precedenti hanno implicato nell’AD, come i Kv3, i Kir2, i canali del potassio calcio-dipendenti, i canali responsabili di correnti del potassio di tipo A, i canali del potassio responsabili dell’iperpolarizzazione postuma. Studieremo inoltre ogni altro canale che, in base ai risultati degli esperimenti delle precedenti fasi, potremo ipotizzare essere implicato. Data la difficoltà del controllo del voltaggio in neuroni adulti con un esteso albero dendritico, inizieremo con registrazioni in configurazione di whole-cell in fettine prelevate da animali giovani, quando i dendriti non hanno ancora raggiunto le dimensioni finali. Il razionale dell’utilizzo di neuroni di animali giovani è che gli effetti della beta-amiloide sono probabilmente indipendenti dall’età. Infatti, è probabile che l’insorgenza tardiva in vivo delle lesioni caratteristiche dell’AD sia da attribuire alla lenta progressione della formazione degli oligomeri del peptide beta-amiloide e non alla sensibilità dei neuroni che ne vengono a contatto. Tuttavia, non escludiamo un’estensione di questo studio delle correnti ioniche a neuroni adulti in cui la registrazione in voltage-clamp può essere resa precisa e affidabile grazie alla configurazione di outside-out o di cell-attached.
FASE 1.3. Lo studio funzionale sarà accompagnato da un’analisi di espressione genica volta all’identificazione degli specifici canali ionici responsabili delle correnti ioniche alterate dalla beta-amiloide. Questa parte del lavoro si baserà sulle tecniche di real-time RT-PCR e di immunoistochimica / immunofluorescenza e verrà effettuata mediante esperimenti in vitro e in vivo. Recentemente è stato concluso nel nostro laboratorio uno studio completo dell’espressione dei trascritti dei canali Kv3 durante lo sviluppo e l’invecchiamento dell’encefalo del topo (Boda et al., 2006; Boda et al., in preparation). Questo studio, finanziato dal precedente PRIN-2005, ci permetterà di interpretare i futuri dati relativi alle disregolazioni di questi canali nell’AD alla luce del loro ruolo nell’invecchiamento fisiologico del cervello. L’effetto del trattamento con il peptide beta-amiloide sulle fettine acute di cervello di topo verrà studiato mediante real-time RT-PCR su singola cellula: i trascritti dei canali ionici candidati verranno quantificati a partire da singole cellule isolate dal tessuto nervoso mediante microsuzione. In parallelo, alterazioni dell’espressione di specifici canali del potassio verranno misurate a partire da singole popolazioni neuronali nei due modelli murini di AD attualmente disponibili. Eventuali alterazioni nel livello di espressione e nella localizzazione delle proteine-canale nei neuroni di questi topi verranno infine esaminate mediante reazioni di immunoistochimica/immunofluorescenza su fettine di cervello.


OBIETTIVO 2: ALTERAZIONI DELL’ECCITABILITÀ DI MEMBRANA E DEI CANALI DEL POTASSIO DELLA SOTTOFAMIGLIA ERG NELL’EPILESSIA.
Nell’ambito del progetto PRIN-2005 avevamo studiato il profilo di espressione dei membri della sottofamiglia erg mediante immunoistochimica (Guasti et al., 2005). Un’intensa espressione in diversi tipi cellulari nell’ippocampo, nel nucleo reticolare del talamo e nella corteccia cerebrale ci aveva indotti a ipotizzare un coinvolgimento nell’epilessia. Dal punto di vista funzionale, l’attivazione sottosogliare dei canali erg e la dimostrazione del loro ruolo nel controllo dell’eccitabilità di membrana (Sacco et al., 2003) sono in linea con un coinvolgimento nell’epilessia. Infatti, in seguito ad una ricerca di mutazioni del gene herg3 in pazienti epilettici in cui altre cause note erano state escluse, il laboratorio della prof.ssa Arcangeli dell’Università di Firenze ha rivelato una mutazione di KCNH7/herg3 in un paziente con epilessia idiopatica con assenze. L’Unità di ricerca di Milano-Bicocca ha dimostrato che il canale herg3 portante tale mutazione produce una corrente aumentata rispetto al canale herg3 di controllo. Questo risultato suggerisce che la mutazione del gene KCNH7 possa essere la causa dell’epilessia idiopatica con assenze nel paziente analizzato.
FASE 2.1. Il ruolo della nostra Unità Operativa sarà quello di dimostrare il collegamento tra la corrente erg e l’epilessia mediante diversi approcci sperimentali. In una prima serie di esperimenti indurremo in topi una crisi epilettica mediante somministrazione di una sostanza epilettogena. Dopo l’osservazione e la quantificazione dello stadio convulsivo raggiunto da ogni animale, nelle regioni encefaliche implicate quantificheremo l’espressione dei geni erg. Specifiche aree cerebrali e popolazioni neuronali verranno isolate dal resto dell’encefalo. Da queste verrà estratto l’RNA e, successivamente alla sua retrotrascrizione, verranno effettuati esperimenti di quantificazione dei trascritti mediante real-time RT-PCR. Il razionale di questo esperimento è che in molti casi descritti, i geni implicati nell’epilessia, oltre a causare le crisi epilettiche, subiscono anche una modulazione del loro livello di espressione in seguito ad epilessia indotta sperimentalmente. Tale modulazione può essere implicata nella progressione della malattia. Per esempio, nel caso di una corrente come quella erg che smorza l’eccitabilità di membrana, una sua diminuzione può avere un effetto aggravante mentre un suo aumento può avere un effetto protettivo. Risultati in questo senso potrebbero suggerire un nuovo bersaglio per le terapie antiepilettiche.
FASE 2.2. In una seconda serie di esperimenti, le conseguenze funzionali dell’inibizione e del potenziamento delle correnti erg verranno studiate dall’Unità di Milano-Bicocca con la tecnica dei multi-electrode-arrays e dalla nostra Unità mediante registrazioni da singola cellula in fettine di tessuto nervoso.
FASE 2.3. Il laboratorio della prof.ssa Arcangeli, con cui collaboriamo, sta lavorando alla generazione di un topo knock-out per erg3 e intende generare un topo knock-in portante la mutazione scoperta nel paziente epilettico. Una terza serie di esperimenti del nostro laboratorio sarà volta a studiare le alterazioni comportamentali ed elettrofisiologiche di tali topi.