RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO-BICOCCA - BIOTECNOLOGIE E BIOSCIENZE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enzo Wanke

Descrizione

Gli obiettivi proposti per il primo anno di attività sono i seguenti:
OBIETTIVO 1.1): CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA MUTAZIONE MISSENSO IN EPILESSIA GEFS+
Mutazioni nel gene SCN1A sono state associate a diverse patologie umane ed in particolare a forme di epilessie idiopatiche (Epilessia generalizzata con convulsioni febbrili plus (GEFS+), Epilessia mioclonica severa (SMEI) e Epilessia generalizzata con crisi tonico-cloniche (GTCS)), a forme di emicrania emiplegica familiare, alle convulsioni febbrili e all’autismo. Da anni la Dr. Combi si occupa di studiare le basi genetiche delle epilessie e recentemente si è occupata di ricercare mutazioni nel gene SCN1A in un casistica di individui affetti da epilessia. Durante questo studio è stata identificata in un paziente affetto da GEFS+ una mutazione missenso (C.1625 G>A R542Q) nell’esone 10 del gene SCN1A già precedentemente riportata in letteratura come associata all’autismo (6). Tale mutazione, risultata assente in un campione di controllo composto da 100 individui sani, non è però mai stata studiata la sua funzionalità. Poiché il canale è noto può essere modulato mediante fosforilazione delle tirosine (7), la mutazione potrebbe alterare la regolazione dell’attività del canale. Da studi in silico è emerso come tale mutazione rompe proprio un sito predetto di fosforilazione delle tirosine presente nel primo loop citoplasmatico. Tale sito (con sequenza consenso RLTYEKRY) è presente solo nella subunità SCN1A (come si può vedere nell’allineamento mostrato al termine di questo paragrafo dal quale si evince anche come la mutazione in esame colpisce un residuo di Arginina altamente conservato in quanto presente in tutti i canali del sodo espressi nel SNC) e, quindi, probabilmente tipico del meccanismo di regolazione di questa proteina.

COMPITO: Gli esperimenti saranno fatti con la tecnica del patch-clamp usando cellule HEK293 transfettate transientemente con i canali hNav1.1 normale e mutato in presenza o assenza della subunità accessoria beta1, come riportato in precedenza (2,4). La proteina mutata verrà ricostruita inserendo la mutazione individuata, mediante mutagenesi diretta sito specifica utilizzando il kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), in un vettore di espressione contenente il cDNA wild-type e già presente nel nostro laboratorio. La presenza della mutazione nel vettore così ottenuto verrà controllata mediante sequenziamento diretto del DNA plasmidico.
Da un punto di vista generale, le mutazioni missenso verranno analizzate facendo esprimere la proteina mutata in cellule di mammifero in coltura e confrontando la sua funzionalità biofisica con quella della proteina wild-type. Vista l’importanza del putativo ruolo di fosforilazioni a livello dell’ansa citoplasmatica (7) dove è posizionata la mutazione, saranno fatti esperimenti atti a rivelare il ruolo della fosforilazione da tirosin-chinasi. Infatti studi precedenti hanno mostrato che la de-fosforilazione rallenta la inattivazione del canale modificando la sua voltaggio-dipendenza e la densità di corrente (7). Se necessario, faremo esperimenti non solo a temperatura ambiente ma anche a temperatura febbrile di circa 40-41 °C.

OBIETTIVO 1.2): UNA MUTAZIONE EPILETTOGENA UMANA SUL GENE KCNH7 E IL SUO RUOLO FUNZIONALE NEGLI ETERO-CANALI DELLA FAMIGLIA ERG PRESENTI NEL SNC.
E’ noto che i tre membri della famiglia dei canali ERG sono capaci di formare canali etero-tetramerici funzionali (26). Inoltre, molti lavori recenti suggeriscono che questi canali etero-tetramerici hanno proprietà biofisiche di possibile nuovo interesse fisiologico. Queste risultanze e quelle menzionate al punto STATO DELL’ARTE, relative alle differenti proprietà biofisiche del canale WT e del mutato, aprono una nuova area di indagini sul ruolo di possibili mutazioni epilettogene nei membri ERG2 e ERG3 nelle fasi precoci postnatali durante le quali forti modificazioni dell’espressione dei canali sono evidenti (12). Un modello suggerisce che neuroni esprimenti la forma mutata rimarrebbero silenti a causa dell’innalzamento della soglia indotto dal guadagno di funzione del canale mutato. Inoltre, l’influenza relativa di mutazioni sulle tre forme etero-compatibili aprono un’interessante indagine mai tentata finora sulla funzionalità degli etero-canali.
COMPITI. La tecnica del patch-clamp in configurazione a cellula intera verrà usata per questa parte delle misure. Poiché non sappiamo le regole che sottendono alla formazione degli eterotetrameri, una larga serie di prove differenti sarà necessaria per capire come stechiometrie differenti possono essere riconosciute attraverso l’analisi biofisica della voltaggio-dipendenza. Questi risultati potranno essere usati con successo per studiare l’eterogeneità presente nei neuroni del SNC. Molto recentemente, l’unità del prof. Pessia a Perugia sta studiando le proprietà dei neuroni del nucleo vestibolare e ha scoperto che la loro eccitabilità è fortemente dipendente dai canali ERG. Dunque apriremo una collaborazione per studiare in quale modo i canali ERG, putativamente mutati, influiscono nel ruolo fisiologico di questi neuroni centrali. Al contrario, l’unità del prof. Tempia a Torino è interessato alle alterazioni dell’espressione genica delle tre isoforme KCNH indotte da crisi epilettiche. Sarà interessante osservare come i loro risultati possano aiutare a capire le nostre osservazioni sulla propagazione di una mutazione KCNH7 “gain-of-function” negli etero-canali da noi studiati a livello funzionale.

OBIETTIVO 1.3): CARATTERISTICHE FUNZIONALI IN RETE DI UNA MUTAZIONE EPILETTOGENA ADNFLE RICOSTRUITA SU TOPO KNOCK-IN.
Una delle conseguenze più comuni della produzione di topi knockout per una particolare proteina, è il modesto grado di sofferenza di questi animali. Ciò è dovuto primariamente alla ridondanza di proteine simili e al loro vicariamento per la proteina perduta. Va anche ricordata la mancanza di conoscenze sul ruolo che la proteina mutata può avere a livello della eccitabilità nervosa: se è localizzata in neuroni eccitatori o inibitori, se è localizzata sulle membrane pre- o post-sinaptiche, ecc. Per rispondere a tali domande è necessario fare molti esperimenti su fettine del tessuto compromesso nei topi normale e KO e poi confrontare i risultati. A causa della già citata ridondanza di proteine simili e l’eterogeneità delle cellule bisogna avere molta fortuna nel trovare, nei preparati di controllo e in quelli mutati, cellule che differiscono nel loro comportamento.
Un alternativa intelligente a questa procedura, lunga e dal risultato incerto, è quella di osservare l’attività simultanea multineurale (tecnica MEA) di una piccola area del tessuto compromesso nelle due condizioni. Come illustrato nella parte STATO DELL’ARTE relativa alle figure 2, 3 e 4, questa attività proviene dall’interazione (a livello inibitorio e eccitatorio) di molti elementi simili (centinaia di neuroni) e connessi (da migliaia di sinapsi) e dunque possiede caratteristiche intrinseche ben precise. A questo proposito, e anche come conseguenza di precedenti collaborazioni stabilite con il gruppo del prof. G. Casari del DIBIT di Milano, abbiamo intrapreso una serie di esperimenti su reti di neuroni corticali post-natali in coltura ottenute da topi knock-in per una mutazione umana per l’epilessia ADNFLE (1) per vedere se l’attività di queste reti fosse differente da quella delle reti WT. Abbiamo voluto verificare se nelle nostre reti WT esiste una corretta espressione delle proteine che funzionalmente danno origine alla attività elettrica in vitro. Illustriamo in questa sede (vedi Fig. 6) le curve dose-risposta ricavate durante esperimenti disegnati per saggiare l’elevata sensibilità della attività della rete a diversi composti (vedi legenda).

Come si può osservare, in tutti questi casi e in altri non mostrati, l’attività della rete è fortemente e fisiologicamente controllata dalle proteine al momento del loro blocco funzionale. Durante analoghi esperimenti preliminarmente effettuati su reti cresciute da tessuto proveniente da topi portatori della mutazione ADNFLE (1, 27), abbiamo osservato saltuariamente fenomeni di riverberanti “anomali” del tipo di quello illustrato nella sottostante figura 7.

Le registrazioni continuative (9 ore) da reti WT (circa 5000 bursts, simboli neri) e mutate (simboli blue) sono state analizzate studiando la distribuzione delle durate dei bursts come si mostra nella figura 8.

Complessivamente, da un’analisi su 13 esperimenti ADNFLE e 39 esperimenti WT, si vede che solo il 28% delle reti WT manifesta episodi epilettici. Al contrario, l’84 % delle reti mutate possiedono episodi epilettici che consistono in frequenti crisi prolungate di attività parossistica. Per queste ragioni la tecnica si presta ad indagini utili per individuare precocemente canalopatie.
COMPITI. Per svolgere questo obiettivo studieremo le reti anche durante l’azione di bloccanti specifici per le sinapsi eccitatorie e inibitorie per capire quali sono le origini del fenomeno anomalo. Si studieranno sia la inibizione GABAergica tonica che quella fasica e l’azione di farmaci anti epilettici. L’unità MEA in nostro possesso verrà rapidamente aggiornata per poter fare esperimenti anche su fettine adese alla piastra multielettrodo provenienti da topi neonatali e adulti nei quali il fenomeno epilettico è facilmente osservabile.
Una collaborazione verrà attivata con la unità operativa del prof. Pessia per lo studio del topo KO per il canale Kv1.1 (anche noto come KCN1A, 28) che presenta attacchi epilettici spontanei durante la vita adulta ed è disponibile nel suo laboratorio. Una seconda collaborazione sarà con il prof. Tempia di Torino che studia diversi modelli di topi “Alzheimer”. Infatti da esperimenti preliminari abbiamo potuto osservare un interessante risultato preliminare ottenuto applicando la proteina betamiloide alla rete (vedi legenda).
Una terza collaborazione, sulla stessa linea, verrà aperta con l’unità di Padova diretta dalla prof. D. Pietrobon, per studiare, in fettina di corteccia, il topo knockin che porta una mutazione della canalopatia FHM-1. E’ noto che in questo caso la fettina è più suscettibile al fenomeno della “cortical spreading depression” (29).

ATTIVITÀ PER IL SECONDO ANNO:
OBIETTIVO 2.1): RICERCA DI ULTERIORI NUOVE MUTAZIONI NEL GENE SCN1A MEDIANTE SEQUENZIAMENTO GENICO IN UN’AMPIA CASISTICA DI PAZIENTI AFFETTI DA VARIE FORME DI EPILESSIA E IN DUE FAMIGLIE DI PAZIENTI AFFETTI DA AUTISMO E EPILESSIA
La Dr.ssa Combi fa parte di un network di lavoro (diretto dalla Prof.ssa Canevini dell’Azienda Ospedaliera S. Paolo di Milano), composto da molti centri ospedalieri della Lombardia nonché da altri tre laboratori di genetica (Lab. di Genetica Medica del Dip. di Neuroscienze dell’Università di Milano-Bicocca, Lab. di Genetica Molecolare IRCCS “E.Medea” Bosisio Parini, Lab. di Genetica Molecolare dell’Università di Milano), che ha come scopo quello di studiare nella casistica di pazienti seguiti in questi centri (circa 3000 pazienti in totale comprendenti sia casi sporadici che familiari) le basi genetiche delle epilessie. Grazie a tale lavoro congiunto è già attualmente disponibile una banca di sangue derivante da una casistica molto selezionata di pazienti affetti da forme famigliari di diverse sindromi epilettiche precedentemente associate a mutazioni in geni che codificano per canali ionici.
COMPITI: Il compito di questa parte di progetto sarà quello di selezionare all’interno di tale casistica pazienti affetti da fenotipi riconducibili al gene SCN1A e procedere con il sequenziamento dell’intera porzione codificante del gene stesso nonché delle giunzioni esone/introne. Il sequenziamento del DNA alla ricerca di mutazioni sarà effettuato su entrambi i filamenti direttamente sui frammenti di PCR purificati, utilizzando la chimica di sequenziamento ciclico con i dideossiterminatori e grazie alla possibilità di utilizzare un sequenziatore automatico del DNA (ABI-3130, Applied Biosystems). I programmi ChromasPro e Sequence Navigator (Applied Biosystems) saranno utilizzati per la ricerca di mutazioni.
Lo stesso tipo di analisi verrà effettuata su un secondo gruppo di campioni di sangue raccolti dalla Dr.ssa Combi nel proprio laboratorio e prelevati da individui appartenenti a due grosse famiglie caratterizzate dalla presenza di individui affetti da autismo e individui affetti da epilessia. Poiché e noto che entrambe queste patologie possono essere causate da mutazioni nel gene SCN1A, si procederà al sequenziamento di tale gene anche in questa casistica.
In caso di identificazione di nuove mutazioni, la loro assenza verrà verificata in 200 individui di controllo della stessa area geografica del paziente. Questa analisi sarà effettuata tramite Dot Blot e ibridazione con sonde allele specifiche (ASO) sui prodotti di PCR, utilizzando analisi di restrizione o mediante sequenziamento del DNA, a seconda del tipo di mutazione identificata.

OBIETTIVO 2.2): STUDI FUNZIONALI DI MODELLI DI CANALOPATIE UMANE OTTENUTI CON TECNICHE DI TRASFERIMENTO GENICO
Il campo delle canalopatie si muove rapidamente e molte altre mutazioni saranno scoperte nei prossimi anni. Però, ci sono ancora diversi ostacoli da superare prima che i meccanismi di queste malattie siano capiti completamente. Le conseguenze per le funzioni neuronali delle mutazioni possono essere ragionevolmente ipotizzate da estrapolazioni fisiologiche solo se i cambiamenti biofisici osservati sono notevoli. Al contrario, questo approccio può essere di poca utilità se gli effetti delle mutazioni sono più sottili ed è molto difficile estrapolare da questo tipo di risultati la conseguenza per la funzione di una rete di circuiti neuronali. Un approccio potenzialmente promettente è quello di esprimere mutazioni umane in un topo. Infatti, alcuni topi KO sono probabilmente modelli di canalopatie umane di mutazioni per perdita-di-funzione. Sorprendentemente, i topi eterozigoti risultano soltanto lievemente affetti da disturbi o ne sono privi. Per quanto riguarda gli omozigoti, risulta difficile assegnare delle specifiche canalopatie perchè esse tendono a risultare ereditate in modo dominante e i relativi pazienti sono generalmente eterozigoti. Inoltre, per quanto riguarda l’uso dei modelli di canalopatie umane nel topo, esso potrebbe essere valido soltanto se si assume che l’espressione topologica dei canali è la stessa nell’uomo e nel topo (noi non siamo sicuri che questo è corretto, ed inoltre l’assoluta identità biofisico-funzionale della proteina è dubbia).
Attualmente la tecnologia permette, alcune volte, di attivare o disattivare le mutazioni con manipolazioni che non disturbano la vita del topo. Ciò permette l’osservazione del fenotipo indipendentemente dal programma rigido presente durante lo sviluppo, con indubbi vantaggi ma anche con probabili svantaggi. Il merito di questa metodica è quello di permettere una semplice manipolazione farmacologica della attività della rete con specifici bloccanti o noti farmaci.
COMPITI: Ci sono varie procedure per raggiungere lo scopo di inserire geni in neuroni in coltura (31). Sebbene esistano ottimi esempi di tecniche di trasferimento genico a mezzo di vettori virali (32, 33) attraverso l’uso inibitorio di dominanti negativi, attualmente esistono varie metodiche anche non virali per raggiungere lo stesso scopo. (Transmessenger reagent, Qiagen). Queste tecniche, che noi adotteremo, sono state provate anche con cellule nervose criopreservate in colture fatte nelle celle di tipo MEA (34). Più recentemente, anche in colture primarie, la tecnica di trasfezione è stata usata con successo per studiare sinapsi e neuroni GABAergici (35). Come illustrato e suggerito nell’obiettivo 1.3, l’analisi statistica dei dati ci permetterà di osservare, se ci sono, le alterazioni causate dal trasferimento genico.