RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università di riferimento

Università degli Studi di PERUGIA - MEDICINA INTERNA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Mauro Pessia

Descrizione

Aim 1: Meccanismi molecolari dell’EA1
Recentemente abbiamo identificato una nuova mutazione nel gene KCNA1 di una famiglia siciliana affetta da EA1 e da epilessia mediante condivisione di aplotipo e mediante l’analisi mutazionale (risultati pubblicati in forma di abstract: Imbrici et al., 2007b; articolo in fase di revisione). La mutazione F414C cambia un residuo molto conservato nella regione C-terminale della subunità Kv1.1. La caratterizzazione funzionale del canale mutato, la quale è stata fatta mediante l’uso del TEVC (vedi Imbrici et al., 2007a e le procedure sperimentali) ha dimostrato che la mutazione causa la perdita completa delle funzionalità del canale omomerico. Inoltre, questa mutazione altera marcatamente il gating dei canali eteromerici. Diverse cause possono provocare la perdita della funzionalità del canale: la mutazione F414C potrebbe influenzare i processi di trafficking del canale, annullando l’inserimento dei canali omomerici sulla membrana della cellula. In alternativa i canali potrebbero essere posizionati normalmente sulla membrana ma non sono in grado di aprirsi. Per rispondere a queste domande proponiamo di analizzare sia l’intensità della fluorescenza in oociti che esprimono separatamente le proteine di fusione Kv1.1WT-pDsRed e Kv1.1F414C-pEGFP, sia la fluorescenza risultante dalla coespressione di entrambi i construtti, mediante l’uso del microscopio confocale a scansione laser (vedi Imbrici et al., 2004 e le procedure sperimentali). Ci aspettiamo che i risultati ottenuti mediante l’analisi della fluorescenza rossa (WT) e di quella verde (F414C) ci permetteranno di discriminare se queste subunità vengono assemblate e posizionate sulla membrana normalmente, oppure se hanno delle proprietà di espressione difettose, essendo le proteine ritenute nel citosol o degradate dalla cellula stessa.
Maylie ed i suoi collaboratori hanno mostrato che le mutazioni E325D e V408A aumentano la disponibilità del canale rallentando l’inattivazione di tipo N dei canali omomerici ed accelerando il recupero dall’inattivazione; ciò suggerisce che le mutazioni associate all’EA1 possano causare un guadagno di funzione (Maylie et al., 2002). Recentemente, abbiamo confermato questi effetti biofisici studiando l’inattivazione veloce dei canali eteromerici WT e mutati, ottenuti dalla co-espressione della subunità accessoria Kvbeta1 con quelle Kv1.4 e Kv1.1 legate insieme a formare dimeri (Imbrici et al., 2006). Sebbene, i dati biofisici pubblicati siano veritieri, sia il rallentamento della inattivazione di questi canali che un relativo recupero più veloce rappresenta un guadagno di funzione che è, apparentemente, in netto contrasto con la generale perdita di funzione provocata dalle mutazioni associate all’EA1. L’analisi dei livelli d’espressione dei canali dimerici Kv1.4-Kv1.1EA1/Kvbeta1 ha rivelato che le mutazioni non cambiavano i livelli di espressione del canale. Sebbene, le mutazioni associate all’EA1 causano generalmente una marcata riduzione dell’ampiezza delle correnti e, in alcuni casi, un effetto dominante negativo sui canali WT. Questi risultati preliminari suggeriscono che la fusione delle subunità WT con quelle mutate aumentano l’espressione di membrana dei canali mutati, fornendo artificialmente le informazioni di assemblaggio, di “targeting” ed ancoraggio che altrimenti sarebbero difettosi. Per determinare se le mutazioni associate all’EA1 causano degli effetti misti di guadagno e perdita di funzione noi abbiamo coiniettato negli oociti uguali quantità di Kv1.4 e Kv1.1E325D RNAs (1:1). In tal modo si permette il libero coassemblaggio delle subunità con una stechiometria dipendente strettamente dalle proprietà di “trafficking” intrinseche a ciascuna subunità WT o mutata. Noi pensiamo che questo approccio sperimentale mimi le condizioni di eterozigosi della malattia in un modo più fisiopatologico. I risultati preliminari così ottenuti hanno mostrato che la mutazione E325D accelera l’inattivazione di tipo N e rallenta il recupero dalla inattivazione stessa: effetto di perdita di funzione (vedi Fig.1; ). Per confermare con certezza questi dati, noi proponiamo d’investigare ulteriormente le proprietà d’inattivazione di diversi canali mutati, incluso l’F414C appena identificato, utilizzando diversi protocolli di elettrofisiologia e mediante l’analisi della fluorescenza al microscopio confocale. Infatti, per determinare se difetti di sintesi, assemblaggio e “targeting” possono spiegare gli effetti biofisici osservati nei canali eteromerici Kv1.4+Kv1.1EA1, analizzeremo l’intensità della fluorescenza in oociti che esprimono separatamente o insieme le proteine di fusione Kv1.4-pDsRed, Kv1.1WT-pEGFP e Kv1.1EA1- pEGFP. Questi risultati saranno paragonati con quelli ottenuti con i costrutti fluorescenti relativi alle subunità legate insieme come dimeri. Ci aspettiamo che gli esperimenti proposti possano fornire informazioni importanti sui processi biologici cellulari alla base delle alterazioni funzionali del canale e che possano permetterci di dimostrare che le mutazioni associate all’EA1 provocano solo perdita di funzione.

Aim 2: Studio dei meccanismi neurofisiopatologici dell’EA1
E’ stato postulato che l’EA1 è caratterizzata, elettrofisiologicamente, da fallimenti episodici della eccitazione dei neuroni cerebellari, causando atassia parossistica di breve durata ed ipereccitazione dei motoneuroni secondari sostenuta, la quale provocherebbe una continua attività dell’unità motoria simile alla miochimia e alla neuromiotonia. Nella maggior parte dei pazienti gli attacchi sono caratterizzati da andamento a base larga, stimolati da movimenti inaspettati e da corea-atetosi chinesigenica parossistica. E’ importante sottolineare che la distruzione dei lobi flocculonodulari del cervelletto causano perdita dell’equilibrio durante i rapidi cambiamenti di direzione. Inoltre, la lesione del vestibolocerebello causa movimenti irregolari degli arti, andamento a gambe larghe, perdita dell’equilibrio e tendenza a cadere. Altri segni tipici dell’EA1, durante gli attacchi, sono tremori posturali delle braccia ed una alterata risposta del paziente al test del dito-naso (risultano aumentati il tempo di esecuzione, il grado di dismetria e il tremore). Lesioni dello spinocerebello (della parte intermedia e del nucleo interposto) causano dismetria, atassia e movimenti oscillatori (tremore intenzionale o terminale). Infine, lesioni del cerebrocerebello causano perdita di coordinazione e sintomi cognitivi (non imparano le associazione di parole; stereognosia alterata). Queste osservazioni, prese globalmente, suggeriscono che i circuiti localizzati nell’intera corteccia cerebellare possono risultare difettosi nei pazienti affetti da EA1. Questa ipotesi di lavoro è in accordo anche con l’espressione dei canali Kv1.1 nelle regioni juxtaparanodali, nei punti di diramazione degli assoni e nei terminali presinaptici delle cellule canestro (Tsaur et al., 1992; Wang et al., 1994). Inoltre, i topi Kv1.1KO mostrano attacchi epilettici spontanei, alterazioni della propagazione del potenziale d’azione nel nervo sciatico ed una maggior inibizione GABAergica delle cellule del Purkinje (Zhou et al., 1998; Zhang et al., 1999). Recentemente, sono stati generati dei topi knockin con la mutazione V408A, associata all’EA1 (Herson et al., 2003). Questi animali mostrano un fenotipo simile a quello dei topi Kv1.1KO con IPSC GABAergici di aumentata frequenza ed ampiezza a livello delle sinapsi tra le cellule canestro e cellule del Purkinje cerebellari. Questi risultati hanno parzialmente confermato il nostro modello di EA1 (D’Adamo et al., 1999). Ciononostante, i meccanismi alla base dell’aumento di ampiezza e frequenza degli IPSC restano poco chiari. Quindi, saranno effettuate delle registrazioni contemporanee di patch-clamp tra le cellule canestro e le cellule del Purkinje per investigare la possibilità che la rimozione dei canali Kv1.1 possa aumentare le probabilità che i potenziali d’azione si propaghino con successo nei punti di diramazione degli assoni delle cellule canestro, un meccanismo che potrebbe essere responsabile dell’aumentata frequenza degli IPSC (Zhou & Chiu 2001; Herson et al., 2003). L’esperimento sarà eseguito utilizzando fettine cerebellari di topi Kv1.1 +/+, +/- and -/-. I potenziali d’azione saranno evocati nelle cellule canestro mediante l’iniezione di correnti depolarizzanti (nella configurazione whole-cell current-clamp) e contemporaneamente verranno registrati i relativi IPSC nelle cellule del Purkinje (in voltage-clamp). Il rapporto #IPSC/#AP sarà calcolato per i vari genotipi. Studieremo anche le risposte sia delle cellule canestro che delle cellule del Purkinje alla stimolazione delle fibre parallele (10-200 Hz) e delle fibre rampicanti, utilizzando lo stesso schema di registrazione. Si noti che i canali Kv1.1 sono espressi anche negli assoni non mielinizzati e mielinizzati dello strato granulare cerebellare e nel corpo dei neuroni localizzati della oliva latero-superiore e dei nuclei cerebellari (Wang et al., 1994). Quindi, investigheremo anche l’effetto della perdita dei canali Kv1.1 sulla plasticità a breve termine delle sinapsi tra le fibre parallele e le cellule del Purkinje. A tale proposito il rapporto PPF sarà calcolato per tutti i genotipi. Inoltre, dei protocolli standard di stimolazione saranno utilizzati per testare possibili modificazioni della LTD cerebellare a livello della stessa sinapsi (Chung et al., 2003). Non possiamo escludere che le terminazioni presinaptiche delle cellule canestro dei topi Kv1.1 KO abbiano correnti del calcio alterate, causando un aumento della frequenza ed della ampiezza dei IPSC (Herson et al., 2003; Llano et al., 1997; Tan & Llano, 1999). Quindi, analizzeremo le immagini dei flussi di calcio spontanei o evocati dalla stimolazione delle cellule canestro al microscopio confocale utilizzando, fettine cerebellari in coltura prelevate dai tre genotipi. Questi studi saranno eseguiti in collaborazione con l’unità di ricerca del Prof.Tempia. Infine, in collaborazione con l’unità di ricerca del Prof.Wanke studieremo l’attività elettrica spontanea ed evocata di un’ampia popolazione di neuroni mediante le registrazioni con multielettrodi (MEA) su fettine cerebellari, in vitro. Questo esperimento potrebbe evidenziare una alterazione della dinamica della propagazione delle onde di eccitazione e di inibizione attraverso gli strati rostro-caudali della corteccia cerebellare o in diverse microzone del vestibolocerebello, dello spinocerebello e del cerebrocerebello.

Aim 3: Ruolo fisiologico dei canali Kir5.1
I topi Kir5.1KO sono disponibili presso il nostro stabulario, sono leggermente più piccoli dei WT e non mostrano evidenti deficit comportamentali. L’elevata espressione dei canali Kir5.1 nelle cellule del Purkinje suggerisce che questa proteina possa regolare funzioni cerebellari importanti. Quindi, un obiettivo specifico sarà quello di testare la forza muscolare e l’attività motoria dei topi Kir5.1KO. L’attività motoria sarà determinata in un "open field". L’abilità motoria dell’animale sarà determinata utilizzando un apparato “rota rod” (Ugo Basile) misurando il tempo di permanenza dell’animale in equilibrio sul cilindro che ruota a diverse velocità e utilizzando una barra di equilibrio. Sarà registrato e quantificato l’effetto dell’esercizio (treadmill, Exer-6M) e di stimoli stressanti (contenzione; iniezione di isoproterenolo 10 mg/Kg i.p.) sulle performance motorie eseguite sul rota-rod e sulla barra di equilibrio. Nel caso in cui questi esperimenti metteranno in evidenza specifici deficit motori di tipo cerebellare nei topi Kir5.1KO, verranno effettuati esperimenti elettrofisiologici su fettine cerebellari, in vitro, simili a quelli descritti nella Aim 2. In alternativa, stiamo correntemente studiando gli effetti della rimozione dei canali Kir5.1 sull’attività elettrica dei neuroni del locus coeruleus (LC). Infatti, in studi precedenti abbiamo localizzato questo canali nei neuroni del LC (vedi Fig.2; ) ed abbiamo dimostrato che esso conferisce ai canali eteromerici Kir4.1/Kir5.1 una elevata sensibilità alla acidosi citoplasmatica. Per cui, stiamo investigando gli effetti dell’acidosi da ipercapnia sull’attività elettrica dei neuroni dell’LC mediante registrazioni di patch-clamp su fettine di troncoencefalo prelevate da topi +/+ e -/-. L’acidosi indotta dall’ACSF al 15% di CO2 modifica in modo simile la forma dei AP dei neuroni dell’LC sia dei topi +/+ che dei -/-. Questi risultati sono in accordo con il postulato secondo il quale i canali Kir sono chiusi durante l’AP e quindi non dovrebbero regolare la forma dei AP. D’altra parte, essi sono aperti al potenziale di riposo e, quindi, contribuiscono a regolare questo potenziale e la soglia di generazione dei AP. L’analisi dei risultati preliminari ha rivelato che i neuroni +/+ del LC hanno una soglia dei AP più negativa dei neuroni -/- . Inoltre, la ipercapnia aumentava la soglia dei neuroni -/- molto meno di quelli +/+. Restano da stabilire le possibili differenze nel potenziale di riposo dei 3 genotipi. E’ stato mostrato che l’acidosi indotta da ipercapnia aumenta la frequenza di scarica dei neuroni LC e scatena attacchi di panico in soggetti predisposti. Al contrario, la alcalosi ipocapnica diminuisce la frequenza di scarica. La figura 3 mostra che l’ACSF al 15% di CO2 aumenta la frequenza di scarica sia dei neuroni LC +/+ che di quelli -/- in modo simile. Sebbene, l’inizio dell’effetto sembra essere marcatamente ritardato nei neuroni -/-, come se i canali Kir5.1 regolino la dinamica della risposta dei neuroni LC alla acidosi da ipercapnia ( ). Quindi, noi proponiamo di investigare le risposte di questi neuroni sia alla acidosi che all’alcalosi poiché potrebbero rivelare sia il ruolo fisiologico dei canali Kir5.1 che dei meccanismi con importanti implicazioni per le malattie psichiatriche.

Metodi

Voltage-clamp con due microelettrodi (TEVC)
Le registrazioni di TEVC saranno fatte su oociti di Xenopus a ~22°C, 1-8 giorni dopo l’iniezione con l’RNA. Sarà usato un amplificatore GeneClamp 500 (Axon) interfacciato collegato al PC mediante una interfaccia ITC-16 (Instrutech). Le registrazioni saranno fatte nella soluzione contenente: (mM): NaCl 96, KCl 2, MgCl2 1, CaCl2 1.8, HEPES 5, pH=7.4. (vedi Imbrici et al., 2007 per maggiori dettagli).

Registrazioni di patch-clamp da fettine di cervello
Le fettine (180-300 um) saranno prelevate da topi +/+, +/-, -/- e perfuse alla velocità di 2 ml/min con ACSF riscaldata (30-31°C) contenente (mM): NaCl (124), KCl (3), KH2PO4 (1.25), NaHCO3 (26), CaCl2 (3.4), MgSO4 (2.5), D-Glucosio (10), and L-ascorbato (2) ed equilibrata con 95% O2-5% CO2 a pH 7.3. Sarà utilizzato un amplificatore EPC-9 per le registrazioni doppie (HEKA) da neuroni visualizzati con una videocamera Hamamatsu Infrared-Optics e con microscopio Axioskop 2FS (Zeiss). L’elettrodo del patch conterrà (mM): 140 K-gluconate (or K-Methylsulfate), 2 MgCl2, 10 K-HEPES, 0.1 K-EGTA, 4 Na-ATP, 0.3 GTP, pH 7.3.

Microscopia confocale
Gli oociti saranno iniettati con i DNA relativi ai costrutti fluorescenti e le immagini saranno acquisite con ingrandimenti a 103x, utilizzando un microscopio confocale Bio-Rad Radiance2000 e un software Scion Image (NIH; vedi Imbrici et al., 2004 per maggiori dettagli).

Biologia molecolare
Le mutazioni puntiformi saranno introdotte nel gene umano Kv1.1 utilizzando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ed i costrutti saranno generati utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (vedi D’Adamo et al., 1999 per maggiori dettagli).

Preparazione di oociti ed iniezione di RNA
Gli oociti saranno iniettati con 50 nL di cRNAs, incubati a 16°C in media ND96 contenente (mM): NaCl 96, KCl 2, MgCl2 1, CaCl2 1.8, HEPES 5, gentamicina 50 ug/ml (vedi D’Adamo et al., 1999 per maggiori dettagli).