RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Strategie antiapoptotiche nelle degenerazioni retiniche: un approccio multidisciplinare

Università di riferimento

Università degli Studi di PISA - PSICHIATRIA,NEUROBIOLOGIA, FARMACOLOGIA E BIOTECNOLOGIE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maria Claudia Gargini

Descrizione

Nel quadro generale delle attività coordinate nel presente progetto, il compito principale di questa unità è quello di verificare l'integrità funzionale della retina dopo la somministrazione in vivo di inibitori della sintesi di ceramide nel topo mutante rd10. L'ipotesi è che la via metabolica degli sfingolipidi abbia un ruolo nelle degenerazioni ereditarie retiniche e che la inibizione della sintesi di nuova ceramide possa prevenire l'apoptosi dei fotorecettori. Per raggiungere questo obiettivo topi wt e mutanti rd10 verranno studiati prima e dopo: a) iniezioni acute intravitreali di due distinti inibitori della sintesi di ceramide: myriocin e fumonisin, il cui meccanismo di azione è descritto dall' unità 3. b) somministrazione cronica di collirio contenete nanosfere caricate con inibitori della ceramide. Per i dettagli su questo tipo di veicolo che verrà utilizzato negli esperimenti cronici si fa riferimento all' unità 2. Gli effetti indotti da questi composti saranno valutati mediante: a) registrazioni della risposta elettroretinografica (ERG) a diversi stimoli visivi in una varietà di condizioni sperimentali. b) misure di western blot del contenuto di opsina e GFAP da campioni di retina ricavati dagli stessi animali utilizzati per le registrazioni ERG. L' ERG con stimoli a illuminazione uniforme è ottenuto da un flash fotografico montato su una sfera "Ganzfeld" che produce una illuminazione uniforme del campo visivo. I segnali ERG registrati in maniera non invasiva mediante elettrodi esterni forniranno informazione sulla integrità funzionale delle cellule che contribuiscono alla risposta integrata. Questa informazione è importante sia per diagnosticare malattie retiniche in soggetti umani che per progredire nella conoscenza della normale funzione retinica. Tuttavia lo sfruttamento completo diagnostico e scientifico dell' ERG richiede che il contributo da parte dei molti tipi diversi di cellule nella retina possa essere identificato. In questa prospettiva le registrazioni ERG saranno analizzate nei loro singoli componenti e ogni alterazione rilevata potrà essere attribuita ad un determinato elemento retinico. La risposta ERG consiste principalmente nella somma delle correnti generate dai segmenti esterni dei bastoncelli riflesse nella componente PIII e da quelle generate dalle cellule bipolari riflessa nella componente PII. La componente PIII può essere utilizzata eliminando la componente PII mediante applicazione di APB, un procedimento che blocca la trasmissione dei segnali dai fotorecettori ai neuroni di secondo ordine. La PII può essere a sua volta ottenuta sottraendo dall' ERG intatto la componente isolata del PIII (Gargini et al. 1999). In questo modo valuteremo sia la funzione che la sopravvivenza dei bastoncelli che quella dei coni. Il contributo dei bastoncelli all' ERG sarà isolato mediante l' analisi della fase iniziale dell' onda a (se presente)ottenuta in condizioni scotopiche di adattamento al buio. In assenza di una onda a misurabile il contributo dei bastoncelli verrà valutato attraverso l' analisi dell' ampiezza e della cinetica dell' onda b. Il contributo dei coni sarà ottenuto in condizioni fotopiche di adattamento alla luce mediante la presentazione di uno stimolo costituito da una coppia di flash in rapida successione. E' ragionevole ritenere che l' ERG fotopico, quello dei coni, rimanga preservato piu' a lungo di quello scotopico dei bastoncelli, poichè mentre la degenerazione dei bastoncelli inizia precocemente ed è causata dal difetto genetico primario, i processi degenerativi che determinanao la morte dei coni sono piu' lenti e potrebbero essere piu' sensibili alle variazioni dei livelli di cermide. Tutti gli esperimenti verranno condotti nel rispetto delle regole internazionali e nazionali per l' utilizzo di animali a scopo sperimentale; inoltre sarà cura di minimizzare al massimo possibile sia il numero di animali utilizzati sia le possibili sofferenze inflitte. Gli animali da usare sono gli rd10 omozigoti su di un ceppo C57Bl6J. Questi animali sono portatori di una mutazione missense della subunità beta della fosfodiesterasi specifica dei bastoncelli (beta-PDE) che porta ad una degenerazione massiva dei bastoncelli a partire dalla seconda settimna di vita postnatale (P14). Successivamente si osserva anche una degenerazione piu' lenta a carico dei coni. La risposta elettroretinografica dei bastoncelli è stata registrata fino a P28 (Changnetnal. 2002; Gargini et al. 2007). Gli animali di controllo appartengono al ceppo C57Bl6J (wt) i topi saranno mantenuti in un ambiente con un ciclo di illuminazione luce/buio di 12/12 ore; cibo ed acqua saranno forniti ad libitum durante la fase luminosa l'intensità della luce sarà mantenuta al di sotto dei 60 lux.
Trattamento acuto: l' unità II (Dott.ssa Strettoi)effettuerà le iniezioni intraoculari negli animali che saranno poi trasferiti presso questa unità (unità 1) per gli esperimenti elettrofisiologici.
Un volume di 500 nanolitri di una soluzione contenente quantità micromolari di un inibitore della sintesi di ceramide disciolta sarà iniettato nell’occhio destro di gruppi test di topi wt e rd10. Negli stessi animali un identico volume di soluzione priva dell’inibitore sarà iniettata nell’occhio sinistro che servirà da controllo. Allo scopo di escludere che l’occhio controlaterale a quello iniettato con la soluzione test possa essere contaminato per diffusione dell’inibitore, verrà fatto un ulteriore controllo su gruppi distinti di animali in cui in entrambi gli occhi saranno iniettati o la soluzione test o quella di controllo. Le iniezioni saranno praticate a P19, pochi giorni prima del picco della morte cellulare, stimato attorno a P24 (Gargini et al. 2007). Le risposte ERG verranno registrate a P21.
Trattamento cronico: poichè la somministrazione cronica di sostanze mediante iniezione vitreale risulta piuttosto invasiva e potrebbe portare a sequele negative quali la cataratta che interferiscono con una corretta registrazione di risposte ERG, le sostanze da testare verranno somministrate mediante applicazione di gocce oftalmiche contenenti un veicolo a base di nanosfere. Queste nanosfere sono costituite da particelle lipidiche del diametro di circa 200 nm, possono attraversare le membrane trasportando molecole attive con le quali sono state preventivamente caricate. Questo veicolo viene fornito all’ Unità II (Dott.ssa Strettoi) dal Dott. Gasco (Nanovector Biotech). Gli esperimenti cronici verranno condotti somministrando giornalmente, mediante instillazione oculare, il veicolo con le nanosfere caricate con l’inibitore della biosintesi di ceramide ai topi rd10 nell’intervallo tra P19 e P27. I controlli funzionali, morfologici e biochimici sugli effetti della somministrazione dell’inibitore saranno feettuati a P30 rispettivamente da parte delle tre Unità secondo i rispettivi compiti.
Per le misure ERG I topi verranno fatti adattare all’oscurità per una notte intera. Manteendoli sempre al buio saranno quindi anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoetanolo (avertina, 15 mg/Kg). L’animale anestetizzato sarà adeguatamente termoregolato mantenedo la temperatura corporea a 37 C con l’ausilio di una coperta elettrica.Le condizioni cardiocircolatorie saranno controllate attraverso la registrazione dell’elettrocardiogramma. La pupilla sarà mantenuta dilatata mediante instillazione di atropina nel scco congiuntivale. La cornea sarà matenuta umida meiante applicazione di un sottile strato di metilcellulosa.
L’ERG verrà registrato mediante elettrodi costituiti da sottili spirali in oro poste a contatto con la cornea. Una piccola piastra d’oro piazzata nella cavità orale servirà da elettrodo di riferimento. La registrazione verrà fatta con procedimenti standard utilizzati in studi precedenti (Gargini etal. 1999). Per la stimolazione uniforme del campo visivo dell’animale si utilizzerà un diffusore a sfera del tipo “Ganzfeld” con sorgenti luminose costituite da LED verdi o blu-verdi con controllo elettronico della durata del flash e della luminanza (National Instruments LabVIEW 6.1). La risposta da parte dei coni sarà isolata impiegando la tecnica della coppia di flashs (Hetling et al. 1999, Freiburg et al. 2004). Questo procedimento consente di registrare la risposta ad un flash test dopo aver sottoposto la retina alla stimolazione con un flash condizionante di intensità saturante. La risposta al primo flash (condizionante) contiene sia il contributo dei coni che quella dei bastoncelli, quella al secondo flash (test) contiene prevalentemente il contributo dei coni in quanto in queste condizioni I bastoncelli sono ancora saturati per effetto del primo flash. La risposta isolata dei bstoncelli si potrà ottenere mediante sootrazione digitale della risposta dei coni (risposta al secondo flash) da quella mista del primo. La luminanza dello stimolo sinusoidale sarà data dalla relazione: f(t) = L(1 + m sin ?t) dove L rappresenta la luminanza media ed m il contrasto. Gli stimoli sinusoidali saranno generati da una unità di stimolazione realizzata appositamente nel nostro laboratorio (Demontis et al. 2005)
Analisi dei parametri ERG: a) Misura e analisi dell’onda –a in condizioni scotopiche: La fase iniziale dell’ond a verrà fittata facendo riferimento al modello di Lamb & Pugh (1992) con la equazione:
F(t) = exp[ -1/2 FA (t - teff)2]dove F(t) è la frazione di corrente circolante nei bastoncelli normalizzata al suo valore nella oscurità. A è un parametro le cui dimensioni sono s-2/ F ed esprime il guadagno della cascata fototrasduttiva (Fattore di amplificazione), infine teff è il termine che include tutti i ritardi sia della risposta che della strumentazione; b) misura dell’ampiezza dell’ond a dei coni in condizioni fotopiche; c) Misure dell’ampiezza dell’onda b in risposta a stimolazioni scotopiche e fotopiche; d) misura e analisi delle risposte ERG a stimoli con luminanza modulata sinusoidalmente nel tempo a frequenze diverse. A termine delle registrazione ERG gli animali verranno sacrificati e le loro retine utilizzate per l’analisi semiquantitativa Western Blot (WB). L’analisi WB verrà condotta misurando l’actina, la opsina e il GFAP dei vari campioni di retina. I livelli di actina verranno utilizzati come valore di riferimento per la normalizzazione di quelli di opsina e GFAP. Il contenuto di opsina fornisce una stima del numero di bastoncelli presenti nel campione, mentre l’espressione di elevate quantità di GFAP è da mettere in relazione al processo degenerativo retinico. La retina di topi wt contengono tipicamente elevate e stabili quantità di opsina mentre il livello di GFAP è basso e limitato agli astrociti. Al contrario, nelle retine di topi mutanti rd10 il contenuto di opsina diminuisce con l’età dell’animale a causa della progressiva degenerazione dei bastoncelli. Corrispondentemente L’espressione del GFPA aumenta. Questi esperimenti saranno realizzati caricando la stessa quantità di proteina e tenendo come riferimento i campioni da wt (wt; rd10 con e senza trattamento).
I risultati saranno espressi come +/- SEM. L’analisi statistica verrà fatta applicando una two- way
ANOVA per paragonare I parametri misurati.

RISULTATI PRELIMINARI

Fig1. Risposte ERG di bastoncelli e di coni in wt (tracce nere) e in rd10 (tracce rosse) ad età diverse (P20 e P26). Si può vedere che sia le onde a e b in risposta al primo flash sono più piccole nell’ rd10. Questa riduzione è la conseguenza della mutazione che altera direttamente la fotocorrente dei bastoncelli e di conseguenza riduce anche la risposta postsinaptica delle cellule bipolari che si riflette nell’ond b. Si noti inoltre come nell’ rd10 a P26 l’onda a sia quasi completamente soppressa a causa della degenerazione massiva che colpisce la retina a questa età. Si può osservare anche che il decorso temporale delle risposte ottenute nel topo wt a P26 è significativamente più rapido che a P20. Questo si spiega con il fatto che gli stadi di maturazione sono diversi alle due età. La componente di risposta ERG dei coni può essere valutata dalla risposta al secondo flash della coppia, Si nota che l’ampiezza di quasta risposta è simile nel wt e nell’rd10 a P20 e P26. Queta osservazione è a sostegno dell’idea che a queste età il sistema dei coni non è ancora andato incontro a processi degenerativi di rilievo.

Fig 2. Analisi WB per opsina e GFAP in campioni retinici di wt e rd10 a P20. Gli esperimenti sono stati realizzati caricando la stessa quantità di proteina (15 microgrammi) e prendendo I campioni da wt come controllo. Le bande sono visualizzate e quantificate a mezzo di metodi Chemo-luminescenti
Il contenuto proteico di ciascun campione è stato stimato misurando la densità ottica della banda di 39 kD per l’opsina e di 42 kD per il GFAP. Il diagramma in basso mostra I rapporti di densità ottica per opsina /actina e per GFAP / actina ottenuti dai blotting. I dati riportati sono la media di misure fatte su tuuti gli esperimenti di WB (6 wt e 6 rd10).