RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Strategie antiapoptotiche nelle degenerazioni retiniche: un approccio multidisciplinare

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - MEDICINA, CHIRURGIA, ODONTOIATRIA - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Paola Signorelli

Descrizione

Dati preliminari, ottenuti nel nostro laboratorio in collaborazione con le altre due unità di questo progetto, mostrano che i livelli di ceramide, misurati in espianti di retina di topi rd10, aumentano nel periodo in cui ha inizio la degenerazione dei bastoncelli, che raggiunge il suo picco intorno al giorno 24 (P= giorno). I livelli di ceramide misurati a questa età risultano essere significativamente maggiori nel topo rd10 che nel wild type.












La nostra ipotesi è che il ceramide si accumuli nei bastoncelli dei topi rd10, comportando l’avvio irreversibile del processo apoptotico.
Supponiamo infatti che lo stress cellulare, causato dalla mutazione genica, sia in grado di alterare l’omeostasi degli sfingolipidi e modulare l’attività di alcuni enzimi in modo tale da indurre l’accumulo di ceramide apoptotico, con una specifica origine intracellulare. In particolare, ipotizziamo anche che il ritmo di sintesi de novo di ceramide aumenti durante la degenerazione retinica dei topi rd10.

Obiettivi specifici
L’obiettivo della nostra unita' di ricerca è di comprendere il ruolo dei mediatori sfingolipidici nell’insorgenza e nella progressione della RP, grazie allo studio delle alterazioni di specifici percorsi metabolici da eseguirsi in stretta associazione con un’analisi di tipo morfologico e funzionale, garantita dalle altre due unità facenti parte del gruppo di ricerca presentante il presente progetto.
Obiettivo specifico 1:
convalidare i dati preliminari e dimostrare che i livelli di ceramide aumentano progressivamente nella retina di topi rd10, in concomitanza alla progressione della degenerazione retinica e confrontare tali livelli con quelli misurati nei topi wild type della stessa età.
Obiettivo specifico 2:
dimostrare che il trattamento con miriocina, un inibitore dell’enzima regolatorio della sintesi de novo di ceramide serina-palmitoil transferasi (SPT), o con fumonisina b1, un inibitore di una reazione diversa nell’ambito della sintesi de novo di ceramide catalizzata dall’enzima sfingosina-N-acil transferasi, riduce l’accumulo di ceramide nelle retine dei topi rd10.
Obiettivo specifico 3:
dimostrare che l’attività e l’espressione dell’enzima regolatorio della sintesi de novo di ceramide (SPT) sono modulati in funzione dello stadio di degenerazione della retina nei topi rd10.
Obiettivo specifico 4:
dimostrare che il trattamento locale in vivo dei topi rd10 con gli inibitori della sintesi di ceramide riduce l’apoptosi dei fotorecettori ed anche la perdita della funzione visiva.



OBIETTIVO SPECIFICO 1
Razionale
In esperimenti preliminari abbiamo mostrato che i livelli intracellulari di ceramide aumentano intorno alla terza settimana dalla nascita, in contemporanea con il picco di apoptosis che si verifica nei fotorecettori. In questo gruppo di esperimenti intendiamo misurare l’aumento di ceramide sia nei topi rd10 sia negli animali di controllo wild type, sia prima che dopo l’insorgenza di apoptosi , ai tempi P10, P19, P21, P30, P35 e P60, in modo da poter valutare l’andamento dei livelli di ceramide nelle retine in degenerazione e nelle retine normali. Confronteremo inoltre i livelli di ceramide misurati nella retina con quelli di frazioni arricchite in fotorecettori.
Metodi
Gli espianti retinici e le frazioni arricchite in fotorecettori di topi rd10 e wild type, a differenti stadi di degenerazione ed età, saranno forniti dalle altre unità, come descritto. I campioni saranno processati per l’estrazione dei lipidi mediante il metodo Bligh Dyer e il ceramide verrà quantificato grazie al saggio della diacil glicerolo chinasi (22) e normalizzati sul contenuto totale di fosfolipidi e di su quello delle proteine.
Risultati attesi
Ci aspettiamo che il contenuto di ceramide aumenti nel corso della degenerazione retinica dei topi rd10, a differenza del ceramide presente nelle retine degli animali wild type di uguale età.
Ci aspettiamo anche che la differenza di ceramide tra rd10 e wild type sia maggiormente significativa nel caso in cui le misurazioni vengano fatte nello strato arricchito in fotorecettori che nella retina totale.
Elementi di criticita’
Il trattamento particolare necessario ad ottenere una frazione retinica arricchita in fotorecettori potrebbe risultare tecnicamente difficile e richiedere di combinare insieme piu campioni.

OBIETTIVO SPECIFICO 2
Razionale
In questo gruppo di esperimenti la nostra unità analizzerà gli espianti di retina di topi rd10 trattati con miriocina o fumonisina b1 come descritto dale altre unita’. La miriocina e’ un inibitore della SPT, l’enzima regolatorio della sintesi de novo di ceramide. La fumonisina b1 e’ un inibitore della sfingosina N-acil transferasi, un enzima a valle della SPT nel percorso anabolico di sintesi di ceramide. L’efficacia di questi inibitori e’ legata alla loro concentrazione ed essendo sostanze lipofiliche, scarsamente solubili, la loro somministrazione mediante iniezioni intravitreo riesce a garantirne al massimo concentrazioni micromolari. Il collirio a base di inibitori somministrato per via topica, utilizzabile anche per trattamenti cronici, si presenta quale un perfetto strumento per sperimentare l’effetto di dosi piu’ elevate e ripetute, eliminando il problema dell’invasivita’ della pratica di inoculo intravitreo (che potrebbe anche essere di per se’ responsabile di un minimo rilascio di ceramide). La nostra unita’ misurera’ il contenuto di ceramide delle retine di topi rd10 dopo trattamento acuto o cronico con gli inibitori e lo confrontera’ con quello misurato in animali rd10 non trattati della stessa eta’, allo scopo di capire se la sintesi de novo di ceramide e’ completamente o parzialmente responsabile dell’accumulo di ceramide presente durante il processo di degenerazione retinica.
Metodi
La miriocina e la fumonisina b1 saranno somministrate sia per inoculo intravitreo sia mediante somministrazione topica di un collirio composto da nanosfere riempite di inibitore. Le retine saranno prelevate dopo trattamento acuto (dose singola, 48 ore di trattamento) o cronico (dosi ripetute nell’arco di alcuni giorni) e la valutazione del contenuto complessivo di ceramide verra’ effettuata come precedentemente descritto (obiettivo specifico 1) .
Risultati attesi
Poiche’ la sintesi de novo di ceramide e’ un percorso metabolico attivato in risposta anche a condizioni di stress ed a stimoli apoptotici, prevediamo che l’incremento di ceramide nelle retine dei topi rd10 sia impedito dagli inibitori miriocina o fumonisina b1. Dato che il processo apoptotico necessita di alcuni giorni per arrivare a completamento, noi prevediamo di ottenere risultati piu’ significativi mediante i trattamenti cronici a somministrazioni ripetute degli inibitori.
Elementi di criticita’
Oltre alla sintesi de novo il ceramide, che si accumula in una cellula, puo’ originare dall’attivazione della sfingomielinasi acida o neutra, o da un ridotto ritmo del suo catabolismo o della sua incorporazione in altre molecule sfingolipidiche. Nel caso in cui dovessimo provare che l’inibizione della sintesi de novo non altera i livelli aumentati di ceramide, prenderemo in esame altre vie metaboliche capaci di indurre accumulo di ceramide.

OBIETTIVO SPECIFICO 3
Razionale
Essendo la SPT l’enzima regolatorio della sintesi de novo di ceramide, in questo gruppo di esperimenti noi i) valuteremo l’attivita’ in vitro della SPT , ii) quantificheremo l’espressione della SPT prima ed a vari stadi del processo degenerativo, allo scopo di identificare il momento in cui il metabolismo cellulare comincia a mostrare delle alterazioni prima del verificarsi dell’apoptosi. Questi dati sono particolarmente importanti in quanto consentirebbero di predire il momento opportuno per intervenire con una terapia preventiva.
Metodi
Le retine saranno prelevate da topi rd10 a diversi stadi di degenerazione: P10 (prima che si verifichi l’apoptosi), P19, P21, P30, P35 e P60. Parallelamente saranno prelevate le retine da animali wild types della stessa eta’.L’attivita’ della SPT verra’ valutata con un saggio enzimatico in vitro come descritto precedentemente (21). In breve, le proteine totali saranno estratte dai campioni e la frazione di membrane microsomali (arricchita in membrane dell’ER) sara’ ottenuta grazie ad una prima separazione per centrifugazione a 10,000 x g , dalla quale il supernatante ricavato verra’ ancora posto in centrifuga a 120,000 x g, ricavandone il pellet di membrane microsomali precipitato. Quantitativi uguali di proteine della frazione microsomiale saranno solubilizzati in un buffer appropriato ed incubati con il substrato marcato L-[3H]serina, in presenza di concentrazioni catalitiche di palmitoil-CoA.
L’espressione delle subunita’ regolatoria e catalitica della SPT a differenti stadi della degenerazione retinica sara’ valutata in espianti retinici di topi rd10 mediante real time PCR (RT-PCR) come descritto da altri (23).
Risultati attesi
Ci aspettiamo che l’attivita’ della SPT aumenti contestualmente o prima del processo degenerativo. Crediamo che tale aumento di attivita’ enzimatica sia dovuto ad un aumento dell’espressione dell’enzima.
Elementi di criticita’
Come precedentemente ricordato, il ceramide puo’ accumularsi in seguito all’attivazione di percorsi metabolici diversi. L’aumento della sintesi de novo puo’ risultare da meccanismi di tipo trascrizionale ma anche dalla prolungata stabilita’ dell’RNA messaggero e della proteina o infine dovuto ad una azione diretta sulla attivita catalitica di mediatori apoptotici.

OBIETTIVO SPECIFICO 4
Razionale
Per il raggiungimento di questo obiettivo specifico, il ruolo di questa unita’ e’ limitato alla convalida dei risultati ottenuti dalle altre unita’ mediante dosaggio di ceramide, allo scopo di affiancare le valutazioni di tipo morfologico della apoptosi retinica con l’analisi biochimica della presenza del mediatore apoptotico.
Metodi
La miriocina e la fumonisina b1 saranno somministrate sia mediante iniezione intravitreo sia mediante somministrazione topica del collirio a base di inibitori, come precedentemente descritto. Le retine saranno prelevate dopo un trattamento acuto o cronico (come precedentemente descritto nell’obiettivo specifico 2), i lipidi saranno estratti e il ceramide quantificato come precedentemente descritto (obiettivo specifico 1). I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti dall’analisi al microscopio confocale dei livelli di apoptosi.
Risultati attesi
Ci aspettiamo che il trattamento con gli inibitori sia in grado di ridurre in modo significativo l’accumulo di ceramide e l’apoptosi nella retina dei topi rd10.
Elementi di criticita’
Considerando che le concentrazioni in vivo sono molto diverse da quelle efficaci in vitro, e che la miriocina e la fumonisina b1 non sono ancora mai stati utilizzati in vivo, un mancato raggiungimento del presente obiettivo puo’ essere dovuto alla necessita’ di sperimentare diverse dosi e tempi di trattamento.