RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Strategie antiapoptotiche nelle degenerazioni retiniche: un approccio multidisciplinare

Università di riferimento

Consiglio Nazionale delle Ricerche - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enrica Strettoi

Descrizione

Compiti dell’unità

L’unità dell’Istituto di Neuroscienze del CNR di Pisa ha una esperienza pluriennale negli studi di anatomia funzionale della retina. Pertanto, i partecipanti a questo gruppo contribuiranno in modo specifico al raggiungimento di due obiettivi specifici:

1) Testare l’ipotesi che il pathway degli sfingolipidi sia coinvolto nella degenerazione ereditaria dei fotorecettori (obiettivo comune alle tre unità, alle quali il gruppo CNR fornisce gli animali dopo averli trattati).
Il sistema sperimentale prescelto è il topo portatore della mutazione rd10, modello di Retinite Pigmentosa umana a trasmissione autosomica recessiva, da noi caratterizzato in un recente studio anatomo funzionale (15).

2) Testare l’ipotesi che la somministrazione in vivo di inibitori della sintesi di ceramide nel mutante rd10 prevenga la degenerazione (apoptosi) dei fotorecettori e ne preservi le caratteristiche morfologiche.

Gli obiettivi sopra descritti verranno attuati mediante il seguente programma sperimentale:

1) Somministrazione di inibitori della sintesi de novo di ceramide. Questa sarà attuata mediante iniezioni intravitreali (studi acuti) o tramite la somministrazione topica di colliri a base di nanosfere (studi a lungo termine). Gli animali così trattati verranno destinati a) all’indagine biochimica; b) agli studi funzionali; c) all’analisi morfologica.

2) studio morfologico della degenerazione e della sopravvivenza dei fotorecettori di topi rd10 trattati con inibitori della sintesi di ceramide, di cui al punto 1-c).

I metodi usati nella parte della ricerca specificamente svolta da questa unità, e il programma di lavoro, sono descritti di seguito:

Iniezioni intraoculari: I topi usati per questo studio sono omozigoti per la mutazione rd10 (15, 16) su background C57BL6 ed esprimono una mutazione “missenso” nella subunità beta della fosfodiesterasi dei bastoncelli (beta-PDE) che causa la morte massiccia di queste cellule a partire dalla seconda settimana di vita postatale (P14); in seguito, si osserva una più lenta degenerazione dei coni. L’elettroretinogramma (ERG) può essere registrato fino a P28, e risposte deboli, originanti dai coni, fino a P40. Gli animali di controllo appartengono al ceppo wild type (wt) C57BL6J. Gli animali vengono mantenuti in un ciclo luce/buio di 12/12 hr con acqua e cibo ad libitum e illuminazione ambientale inferiore a 60 lux. Le procedure sperimentali sono conformi alla normativa internazionale ARVO e alle leggi Italiane in materia di sperimentazione animale.

Per le iniezioni intraoculari e il prelievo delle retine, i topi rd10, appartenenti ai gruppi di età P10, P14, P19, P21, P30, P45 e P60, e i rispettivi wt di controllo, sono anestetizzati con iniezioni intra-peritoneali di Avertina (1.2% tribromoetanolo e 2.4% amylene idrato in acqua, 0.02 ml/g peso corporeo). Per ogni gruppo di età, si utilizzano 6-8 animali (solitamente intere nidiate). L’iniezione intraoculare è praticata nel vitreo, in posizione ore 12, in corrispondenza della periferia della retina al margine posteriore della cornea. 500 nanolitri di soluzione (contenente dosi micromolari di uno degli inibitori della sintesi di ceramide, Myriocin o Fumonisin 1), nel rispettivo veicolo, vengono iniettati nell’occhio destro mediante un micromanipolatore idraulico che sostiene un capillare di vetro con punta di circa 0,2 mm. Un uguale volume di solo veicolo viene iniettato nell’occhio sinistro (controllo). L’iniezione a scopo di salvataggio dei fotorecettori è solitamente effettuata pochi giorni prima del picco di degenerazione di queste cellule, stimato intorno a P24 (15). Gli esperimenti preliminari sono stati effettuati con iniezioni a P19 e recupero a P21. Dopo l’iniezione, gli animali vengono restituiti alla madre. Per gli esperimenti acuti, le retine vengono prelevate da animali nuovamente sottoposti ad anestesia 48 ore dopo l’iniezione.
Per i dosaggi biochimici, gli occhi vengono rapidamente enucleati e immersi in soluzione salina ossigenata (ACSF, artificial cerebro spinal fluid). Le retine vengono separate dal polo posteriore dell’occhio e conservate a -80°C in fiale Eppendorf fino al momento del dosaggio, effettuato dall’unità n.3 di Milano, che esegue anche i dosaggi basali di ceramide endogeno su retine isolate nel laboratorio dell’unità di Pisa. Per i dosaggi basali, le retine vengono prelevate da animali anestetizzati, secondo la procedura sopra descritta, ma senza iniezione intraoculare di sostanze. Per questi esperimenti, volti ad accertare l'andamento del ceramide nel decorso naturale della vita dell'animale, sia rd10 che wt, le retine vengono prelevate a 10, 14, 19, 21, 30 e 35 giorni (per coprire l'intero periodo di maturazione dei fotorecettori e della retina) e, infine, a P60.
Nel caso di esperimenti di elettrofisiologia, gli animali sottoposti ad iniezione di inibitori vengono trasferiti presso l’unità n.1 della Prof. Gargini dopo l’iniezione stessa, e lì sottoposti a registrazione dell’ERG.

Per l’analisi morfologica, gli occhi vengono enucleati 48 ore dopo l’iniezione dagli animali anestetizzati, e quindi fissati per un’ora in una soluzione di Paraformaldeide (PAF) al 4% in tampone fosfato 0.1M, pH 7.4, dopo aver preso un riferimento in corrispondenza del polo dorsale. Dopo un lavaggio in tampone, gli occhi vengono infiltrati in una soluzione tamponata di 30% saccarosio e quindi congelati a -22°C e conservati fino all’uso.

Conteggio dei fotorecettori picnotici. Per questa analisi vengono utilizzate retine intere (“whole mount”) estratte dagli occhi di cui sopra. Ciascuna retina viene sottoposta a una step di incubazione in RNAsi e successivamente colorata in Etidio omodimero 2 per evidenziare i nuclei cellulari. Le retine vengono distese su vetrini portaoggetto con i fotorecettori in alto, montate, e quindi osservate a un microscopio confocale Leica TCS (NT o SL). Per ogni retina, si procede all’acquisizione di 32 campi di osservazione, di dimensioni 250x250 micron, spaziati regolarmente lungo i meridiani dorso-ventrale e naso-temporale. In ciascun punto, lo strato nucleare esterno, contenente i nuclei dei fotorecettori, viene sottoposto a scansione completa lungo l’asse zeta, acquisendo un’immagine per ogni micron di spessore. Le immagini relative ad ogni punto vengono poi sovrapposte in un unico piano per ottenere un fuoco “sintetico” nel quale i nuclei delle cellule picnotiche, in stato di attiva apoptosi, appaiono perfettamente identificabili per intensità di colorazione e piccole dimensioni (vedi risultati preliminari). I files corrispondenti a ciascuna retina vengono trasferiti ad una stazione di imaging computerizzato ed analizzati con il programma Metamorph. I profili delle corrispondenti retine vengono acquisiti con una telecamera interfacciata con un microscopio Zeiss e le aree retiniche misurate con il software AxioVision. Le cellule picnotiche vengono contate con l’aiuto di Metamorph, per ottenerne la densità media in ognuna delle retine campionate. Il numero medio di cellule morenti per retina viene stimato moltiplicando la densità media così ottenuta per la corrispondente area retinica. I conteggi vengono ottenuti da un numero variabile di 6-8 animali (solitamente intere nidiate), per ogni punto temporale esaminato. I dati vengono analizzati statisticamente con i pacchetti software Excel e Origin per la determinazione di differenze mediante t test ove appropriato.
Stime analoghe dei fotorecettori apoptotici in retine trattate e di controllo verranno eseguite sottoponendo le retine in whole mount di cui sopra alla colorazione con il metodo del TUNEL, che evidenzia il DNA frammentato tipico delle cellule in fase di morte programmata. Le cellule Tunel positive, rese fluorescenti da un metodo di rivelazione opportuno, verrano osservate e acquisite al microscopio confocale, secondo il metodo appena descritto, di cui il Tunel costituisce un’ulteriore verifica.

Stima della sopravvivenza dei fotorecettori. Per la stima del numero di fotorecettori non apoptotici (e quindi presumibilmente “vivi”), è opportuno utilizzare campioni di retina ridotti in sezioni verticali. Queste saranno ottenute tagliando campioni oculari iniettati con inibitori della sintesi di ceramide (e opportuni occhi di controllo) in sezioni verticali consecutive, prodotte con un criostato. Le sezioni (spesse 14 micron) vengono raccolte su vetrini gelatinati, sottoposte a colorazione con molecole fluorescenti che legano il DNA (Omodimero dell’Etidio o Ioduro di Propidio) e quindi analizzate al microscopio confocale. Per ogni retina, si procede alla scelta di 6 sezioni perfettamente verticali e corrispondenti al piano equatoriale dell’occhio. Le immagini ottenute comprendono lo strato nucleare esterno e hanno lo stesso spessore ottico (ad es. 4 micron), in tutte le sezioni campionate. Per ogni sezione, si procede all’acquisizione di una uguale estensione lineare di strato nucleare esterno. Le immagini vengono poi esportate sulla stazione di analisi di immagine, dove si procede alla misura dello spessore dello strato nucleare esterno, a varie eccentricità retiniche, e al conteggio del numero di file di fotorecettori ancora integri, in esso rappresentate. Infine, per ogni campione retinico si procede alla stima dello spessore medio dello strato dei fotorecettori a varie eccentricità e del numero medio di file di nuclei in funzione della distanza dal nervo ottico. Ciò fornisce un’indicazione sistematica del numero di fotorecettori ancora non interessati dal processo apoptotico. I dati analizzati provengono solitamente da un numero di 4-6 retine di animali diversi per ogni punto temporale esaminato; i dati numerici vengono sottoposti ad analisi statistica mediante i pacchetti software Excel o Origin.

Isolamento di una frazione arricchita in fotorecettori per il dosaggio di ceramide.
Risultati preliminari da noi recentemente ottenuti dimostrano che la retina del mutante rd10 va incontro ad un innalzamento di ceramide endogeno intorno alla terza settimana di vita postnatale, in concomitanza con il picco di degenerazione dei fotorecettori. Per dimostrare che tale innalzamento è principalmente a carico della retina esterna, perchè interessa i fotorecettori stessi, ci proponiamo di effettuare un dosaggio biochimico del ceramide in una frazione retinica arricchita in fotorecettori. Questa sarà ottenuta come segue:
Retine isolate ex vivo da animali rd10 e wt di controllo di età opportuna (P19, P21, P24, P30) saranno incubate brevemente in una soluzione di ACSF ossigenato, distese su rettangoli di Parafilm e congelate di piatto sullo stage di un criostato. Le retine saranno sezionate tangenzialmente in fettine di 20-30 micron, a partire dallo strato dei fotorecettori. Le sezioni esclusivamente comprendenti gli strati di retina contenenti queste cellule saranno collezionate in una provetta Eppendorf. Le sezioni più interne, corrispondenti agli strati profondi della retina, saranno invece separate in altro contenitore. Periodicamente, durante il processo di taglio, una sezione campione sarà raccolta su un vetrino, colorata in modo estemporaneo, ed esaminata al microscopio per la conferma dello strato retinico raggiunto durante il taglio. I campioni così ottenuti da ciascun animale saranno sottoposti a dosaggio biochimico del ceramide dall'unità di Milano. Il risultato atteso è che i livelli relativi di ceramide delle retine wt non cambiano nel tempo, mentre per i campioni rd10 si osserva un incremento della quota proporzionale di ceramide selettivamente nella frazione di tessuto arricchita in fotorecettori.

Esperimenti a lungo termine
Lo studio iniziale da noi intrapreso su animali rd10 trattati a P19 ed esaminati a P21 è volto a dimostrare che l'iniezione intravitreale di Myriocin è in grado di diminuire i livelli endogeni di ceramide nella retina (come evidenziato biochimicamente) e contemporaneamente di ridurre il numero di fotorecettori in fase di apoptosi, visualizzabili con metodi morfologici. Questo studio è basato su un'unica somministrazione i Myriocin e sul recupero delle retine dopo 48 ore dall'iniezione stessa.
Poiché questa ricerca ha un potenziale terapeutico finora inesplorato, riteniamo che sia opportuno estendere le nostre osservazioni sostenendo, se possibile, la sopravvivenza dei bastoncelli per un tempo il più lungo possibile, favorendo anche il mantenimento di una risposta funzionale di queste cellule al naturale stimolo luminoso.
Per questo, proponiamo di somministrare ripetutamente l'inibitore della sintesi di ceramide agli animali rd10, testandone periodicamente la risposta alla luce e la conservazione morfologica dei fotorecettori. Negli esperimenti a lungo termine, intendiamo saggiare le condizioni morfofunzionali sia dei bastoncelli che dei coni. Infatti, è noto che questi ultimi sono strettamente vincolati ai bastoncelli da rapporti di dipendenza trofica, per cui un aumento della durata in vita dei bastoncelli può tradursi in un incremento proporzionalmente più lungo della "viability" dei coni (17, 4). Poiché la somministrazione cronica di sostanze tramite iniezione intravitreale è una procedure invasiva, che potrebbe portare a sviluppo di cataratta con conseguente impossibilità di effettuare accurate registrazioni ERG, questa unità sta attuando esperimenti preliminari basati sull'utilizzo di nanosfere, messe a punto dalla Ditta Nanovector di Torino (18, 19), e rese disponibili tramite la collaborazione con il suo esponente, Ing. Paolo Gasco.
Le nanosfere sono micelle lipidiche di piccole dimensioni (diametro medio 200 nanometri), in grado di veicolare attraverso le membrane molecole attive, racchiuse al loro interno mediante appropriata procedura chimica (18). Studi preliminari da noi condotti sul topo somministrando in forma di collirio nanosfere rese fluorescenti dal caricamento con 6-cumarina, dimostrano che la preparazione ha la capacità di attraversare i tessuti oculari e di concentrarsi specificamente all'interfaccia tra fotorecettori ed epitelio pigmentato, in posizione ideale per il rilascio di molecole destinate ai bastoncelli della retina.
La Myriocin è di per sè una molecola ideale per la somministrazione in nanosfere, in quanto il suo caricamento all'interno delle particelle risulta agevolato dal fatto di essere liposolubile. Riteniamo quindi che il caricamento di Myriocin nelle nanosfere (che sarà adeguatamente messo a punto dalla Nanovector) metterà a nostra disposizione uno strumento potente per somministrare questo e altri farmaci liposolubili alla retina esterna in maniera non invasiva.

Gli esperimenti cronici, all'inizio, saranno effettuati somministrando quotidianamente collirio alle nanosfere/Myriocin ad animali di età P19-P27. Questi saranno testati dalle tre unità del progetto per la parte biochimica, morfologia e funzionale all'età di 30 e 40 giorni. In condizioni normali, a questa età lo strato dei fotorecettori del mutante rd10 è ridotto ad un'unica fila, i livelli endogeni di ceramide retinica sono molto elevati e l'ERG è virtualmente estinto; pertanto, ogni miglioramento indotto dal trattamento sarà rapidamente evidenziabile con ognuno dei metodi di indagine da noi impiegati.

In sintesi, questa unità perfezionerà la via di somministrazione di inibitori della sintesi di ceramide alla retina degli animali rd10 e ne testerà immediatamente gli effetti protettivi sulla sopravvivenza e la morte dei fotorecettori, allo stesso tempo fornendo alle altre due unità il tessuto retinico per l’indagine biochimica e gli animali per l’esame elettrofisiologico.
Il lavoro concertato delle tre unità provvederà a costruire un quadro dettagliato del coinvolgimento degli sfingolipidi nella morte ereditaria dei fotorecettori e del potenziale terapeutico di queste molecole, ancora inesplorate per quanto riguarda le retinopatie eredofamiliari.

Per i risultati preliminari si rimanda al Modello A della presente applicazione.