RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

TECNICHE AVANZATE DI IMAGING MOLECOLARE ED INGEGNERIA GENETICA PER LO STUDIO DELLA DISTRIBUZIONE E DELLA DINAMICA DEL MAGNESIO CELLULARE: NUOVI APPROCCI PER ASSOCIARE LA OMEOSTASI DEL MAGNESIO CON LE FUNZIONI CELLULARI.

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Patologia generale - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Federica Wolf

Descrizione

Lo scopo del programma è di applicare le nuove sonde fluorescenti derivate da una molecola di diaza-18-crown-6 coniugata con due gruppi hydroxyquinoline (DCHQ) per lo studio della distribuzione e dei movimenti di magnesio in "live cell imaging". Partendo dai dati preliminari ottenuti con la sonda DCHQ1 in esperimenti di "live cell imaging" su cellule mammarie HC11 e alcune altre linee cellulari quali fibroblasti Rat1 o Cos, si approfondirà il significato dei dati fino ad ora ottenuti estendendoli ad altri modelli cellulari come le cellule endoteliali messe a disposizione dalla UR di Milano e sulle quali sono stati compiuti diversi studi che hanno descritto l’effetto della disponibilità di magnesio sulla funzione endoteliale (Maier et al.2004).
Risultati preliminari da noi pubblicati (Farruggia and Wolf, 2006) descrivono la identificazione di un transiente rapido di magnesio quando la cellula viene trattata con diverse sostanze che hanno effetto sulla funzionalità mitocondriale. Per meglio caratterizzare la natura e le conseguenze di questo transiente di magnesio si studieranno innanzi tutto i mitocondri isolati. In questo modo si avrà il vantaggio di studiare un singolo compartimento che può essere manipolato in vario modo con l'utilizzo di diverse classi di sostanze il cui effetto è ben noto (per esempio: disaccoppianti della fosforilazione ossidativa, inibitori della respirazione cellulare che agiscono a vari livelli (sito, I, II, III, IV), agenti che perturbano la composizione ionica della matrice come inibitori di canali ionici specifici o del poro di transizione di permeabilità). Dato che tutti questi agenti possono innescare il programma di morte per apoptosi, si cercherà di capire il rapporto tra il transiente di magnesio precedentemente dimostrato (Farruggia, 2006) e i punti chiave del processo apoptotico, primo tra tutti il potenziale di membrana mitocondriale (tecniche di imaging con JC1 o di citofluorimetria). Successivamente si passerà allo studio delle cellule intere sulle quali verranno studiate le conseguenze “citoplasmatiche” del transiente di magnesio per esempio, il rapporto tra questo e altri stimoli associati al fenomeno della apoptosi. In pratica si paragonerà l'effetto di sostanze come i disaccoppianti (FCCP, CCCP etc.) con altri stimoli apoptogeni di tipo recettoriale (Fas etc.) o che agiscono sul poro di transizione di permeabilità mitocondriale (acido arachidonico, acido bongcrekico, attrattiloside, ciclosporinaD). Successivamente verrà valutato il transiente di magnesio in funzione di altri parametri dell'apoptosi (esposizione della fosfatidilserina sulla membrana, rilascio di citocromo c, attivazione delle caspasi etc.) utilizzando fluorocromi specifici, citofluorimetria, immunofluorescenza o western blotting.
A questo proposito potrebbe essere esplorato il rapporto tra rilascio di magnesio e la attivazione delle endonucleasi Ca/Mg dipendenti o le endonucleasi G.
In parallelo con la caratterizzazione fotochimica compiuta dalla UR di Bologna verrà poi utilizzata la sonda DCHQ2, la cui fluorescenza in risposta al legame con il magnesio è più alta della DCHQ1.
La disponibilità di un derivato del DCHQ1 che abbia una localizzazione esclusivamente intracellulare (es. un estere impermeabile alla membrana plasmatica) permetterà di analizzare la risposta cellulare a una serie di stimoli che inducono influsso del catione, quali stimoli ormonali, cAMP, etc. In questo caso si utilizzeranno cellule caratterizzate da una alterata espressione dei canali per l’uptake di magnesio, quali canali TRPM7 o 6, al fine di dimostrare come questi canali ionici controllano la omeostasi cellulare del magnesio, come suggerito dai altri autori(Nadler, 2001; Schmitz, 2003). Ciò può essere realizzato in due modi: A) in cellule adattate a crescere in alto o basso magnesio extracellulare, che hanno verosimilmente modificato l’espressione dei canali per il magnesio. Si tratta delle linee di cellule epiteliali mammarie selezionate nel nostro laboratorio, cresciute in terreno ad alta (45 mM) e bassa (25 microM) concentrazione di magnesio (Sgambato and Wolf, 2001; Wolf, 2004).
B) Alternativamente e in una fase successiva verranno utilizzate le cellule endoteliali geneticamente modificate per l’espressione dei canali TRPM7 e 6 ottenute dalla UR di Milano.
Grazie alla disponibilità di un microscopio confocale con sorgente a due fotoni sarà anche possibile eseguire esperimenti di FLIM (Tadrous, 2000) o FRAP per caratterizzare la distribuzione e le caratteristiche fotodinamiche delle sonde, in modo che dall'analisi associata del comportamento fotochimico di queste sostanze in vitro (esperimenti di Bologna) e in vivo (esperimenti di Roma), si possano acquisire ulteriori informazioni biologiche circa lo stato di legame del magnesio (libero o legato, associato a lipidi o in ambiente acquoso).
Parallelamente si collaborerà con la UR del CNR per mettere a punto il protocollo dell’allestimento dei campioni di cellule per l’analisi synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy (SXRFM). Questo prevede la fissazione più idonea dei preparati e ed il posizionamento su supporti di materiale sintetico che non interferiscano con l’analisi stessa. Sulla base delle indicazioni fornite da recenti studi che utilizzano questa tecnica per la mappatura di altri metalli quali rame e ferro (Yang et al., 2005), si procederà a tentativi per l’identificazione del protocollo più idoneo allo scopo, cioè utilizzando fissazioni con metanolo/acetone o freeze/drying e ponendo i campioni su supporti di materiale sintetico (formvar layer) posto su un supporto da microscopia elettronica. Si tenterà inoltre di marcare gli stessi campioni con una sonda fluorescente specifica per il magnesio (si sceglierà quella più compatibile con la SXRFM) per poter eseguire esperimenti di co-localizzazione.Questo permetterà uno studio del magnesio intracellulare con due approcci diversi che possono fornire informazioni complementari sulla distribuzione e sullo stato libero o legato del magnesio cellulare.

Fasi della ricerca:
I semestre:
1) Studio dei flussi intracellulari di magnesio su mitocondri isolati e cellule intere in rapporto a diversi stimoli su cellule caricate con DCHQ1.
2) Studio della sonda DCHQ2 per esperimenti di live cell imaging, valutazione dei risultati ottenuti rispetto a DCHQ1.
3) Allestimento di preparati di cellule fissate e poste su supporto adatto all’analisi synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy (SXRFM), in collaborazione con l’UR del CNR.
2-3 semestre:
1) caratterizzazione e utilizzo per “live cell imaging” del derivato esterificabile della sonda per l'intrappolamento di questa all'interno delle cellule.
2) studio dei flussi di magnesio attraverso la membrana plasmatica a seguito di stimolazioni ormonali o di fattori di crescita. Rapporto con la espressione dei canali TRPM7 e 6 in cellule HC11 adattate ad alto e basso magnesio. Rapporto con la proliferazione cellulare.
3) Proseguimento in stretta collaborazione con la UR del CNR, dell’allestimento dei campioni per SXRFM.
4 semestre:
1) Studio dei flussi di magnesio sulle cellule endoteliali geneticamente modificate per i trasportatori di magnesio prodotte dalla UR di Milano.
9) Valutazione comparativa dei dati ottenuti con SXRFM e sonde fluorescenti di vario tipo.
10) Comparazione dei risultati sulla mappatura della distribuzione e dei movimenti del magnesio cellulare ottenuti con le diverse tecniche utilizzate dalle varie UR.
11) Strategie per la sintesi di nuovi derivati del DCHQ ( sonde specifici per organuli subcellulari: mitocondri, reticolo, nucleo). Rapporto con l'espressione dei trasportatori del magnesio (canali TRPM7, Mrs2 o altri).

Compiti della UR:
1:Validazione e studio di applicabilità delle sonde DCHQ1 e 2 allo studio della distribuzione e movimenti del magnesio cellulare in live cell imaging. Applicazione di sonde derivate per specifiche localizzazioni sub-cellulari e studio con queste dei flussi di magnesio in cellule con modificazioni di espressione o genetiche dei canali specifici per il trasporto del magnesio.
2:Allestimento dei campioni per l’esecuzione della SXRFM da parte della UR del CNR. I campioni di cellule dovranno essere fissati adeguatamente e posizionati su supporti che non interferiscano con la metodica del SXRFM. Questo lavoro di stretta collaborazione sarà facilitato dalla vicinanza delle due UR che si trovano entrambe nell’area romana. La nostra UR darà piena disponibilità per la produzione delle linee cellulari che si intendono studiare e per l’allestimento dei preparati.