RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

TECNICHE AVANZATE DI IMAGING MOLECOLARE ED INGEGNERIA GENETICA PER LO STUDIO DELLA DISTRIBUZIONE E DELLA DINAMICA DEL MAGNESIO CELLULARE: NUOVI APPROCCI PER ASSOCIARE LA OMEOSTASI DEL MAGNESIO CON LE FUNZIONI CELLULARI.

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - SCIENZE PRECLINICHE "L.I.T.A. DI VIALBA" - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Jeanette Anne Marie Maier

Descrizione

Le cellule endoteliali sono molto sensibili alla variazione delle concentrazioni del Mg extracellulare (Maier, 2004 a e b, Ferré, 2007). Nonostante le evidenze epidemiologiche, cliniche e sperimentali indichino il basso Mg come causa di disfunzione endoteliale, evento basilare nella patogenesi delle malattie cardiovascolari (Maier, 2003), le nostre conoscenze sulla omeostasi cellulare di questo catione è incompleta. I dati biochimici e molecolari indicano l’esistenza di controlli specifici che regolano l’influsso e l’efflusso di questo ione; inoltre molte indicazioni fanno supporre una sua compartimentazione all’interno della cellula, con evidenti implicazioni funzionali. Si sa che le cellule endoteliali esprimono un canale trasportatore del Mg, TRPM-7 (Yao, 2005), e, seppure criticabile per i suoi limiti analitici, uno studio ha dimostrato oscillazioni del Mg intracellulare in risposta ad alte concentrazioni extracellulari di Mg nell’endotelio aortico (Zhang, 1997). Ci proponiamo, pertanto, di studiare con nuove metodiche di imaging molecolare le oscillazioni e la compartimentazione del Mg intracellulare, con particolare interesse alle modificazioni dei pools intracellulari di Mg. Cercheremo di correlare questi risultati con la funzionalità endoteliale, utilizzando cellule endoteliali umane in coltura in cui verrà overespresso o silenziato geneticamente TRPM-7. Il progetto si articolerà in tre fasi che in parte si sovrappongono.
Fase I (mesi 1-8): generazione dei modelli cellulari da studiare. Cellule endoteliali umane di vario tipo sono routinariamente coltivate nel nostro laboratorio. In questo studio proponiamo l’utilizzo di cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVEC, clone C ottenuto da ATCC), considerate un buon modello per studiare la funzionalità endoteliale. La maggior parte dei nostri dati sugli effetti del Mg sono stati ottenuti utilizzando queste cellule (Maier, 2004 a e b, Ferré, 2007). Esperimenti preliminari hanno dimostrato via RT-PCR l’espressione di TRPM-7 nelle HUVEC. Proponiamo di trasfettare le cellule con TRPM-7 o con il suo mutante deleto della regione chinasica per ottenere cellule capaci di esprimere livelli elevati di TRPM-7. I costrutti sono stati ottenuti dal dr. Mazur (INRA, Clermont Ferrand, Francia). Utilizzeremo il mutante deleto della regione chinasica per capire se questo domain è necessario per la funzione del canale e/o se ne modula l’attività di trasporto. Le cellule trasfettate saranno poi caratterizzate per i livelli di TRPM-7 mediante western blot con anticorpi specifici (Abcam). Intendiamo anche ottenere cellule in cui TRPM-7 sia stato silenziato utilizzando small interfering (si) RNA. Nel nostro laboratorio questo approccio è stato utilizzato con successo (Castiglioni, 2007) anche nelle HUVEC (Leidi, ms in preparazione). Intendiamo utilizzare dapprima trasfezioni transienti con almeno tre diverse sequenze di siRNA (QIAGEN Inc.). Come controllo saranno utilizzati siRNA “scrambled”. Dopo 24, 48, 72 ore di trasfezione, valuteremo i livelli di TRPM-7 mediante western blot. Una volta individuata la sequenza più efficiente nell’inibire la traduzione di TRPM-7, essa sarà utilizzata per ottenere un vettore di espressione stabile per trasfettare le HUVEC. I cloni trasfettati saranno selezionati per antibiotico-resistenza, isolati e propagati È noto che i topi knock-out per TRPM-7 muoiono nelle prime fasi dello sviluppo fetale e che cellule eucariotiche silenziate per TRPM-7 vanno incontro ad apoptosi (Schmitz C, 2003), mentre cellule muscolari lisce in cui TRPM-7 è stato inibito transientemente sono vitali (He, 2005). Nel caso in cui le HUVEC non sopravvivessero a un’inibizione stabile dell’espressione del canale, continueremo i nostri studi utilizzando siRNA trasfettati transientemente, dopo un’attenta valutazione dell’inibizione della traduzione di TRPM-7 in cinetica in modo da utilizzare per gli studi successivi le finestre temporali più appropriate. Alternativamente utilizzeremo cloni stabilmente trasfettati che inibiscono solo parzialmente la traduzione di TRPM-7. Ottenere HUVEC capaci di silenziare o esprimere alti livelli di TRPM-7 ci consentirà di capire il ruolo di questo canale nel modulare i flussi di Mg, la sua compartimentazione e, parallelamente, l’eventuale relazione con la funzionalità endoteliale.
Fase II (mesi 6-24). Una volta ottenuti i modelli cellulari geneticamente modificati, inizieremo una serie di studi tesi i) a misurare il Mg intracellulare con metodiche convenzionali e ii) a caratterizzare la funzionalità endoteliale.
i) In questa fase, il Mg intracellulare sarà misurato in collaborazione con le U.O.di Bologna e Roma, che hanno sintetizzato nuove molecole fluorescenti derivate dall’8-idrossichinolina con un’alta affinità e specificità per il Mg e bassa interferenza dovuta al calcio (Farruggia, 2006). Questi traccianti sono ben tollerati dalle cellule e possono monitorare rapidi e transienti movimenti intracellulari di Mg. Pertanto, HUVEC geneticamente modificate per l’espressione di TRPM-7 verranno coltivate in terreni controllo e a varie concentrazioni di Mg (0.1, 1.0 e 3.0 mM) per vari tempi (10 e 30 min, 4 h, 24 e 48 h, tempi accettabili anche nel caso in cui dovessimo utilizzare siRNA transienti). Utilizzeremo terreni con diverse concentrazioni di Mg per vedere l’influenza del Mg extra su quello intracellulare. Anche la cinetica è importante per valutare se le eventuali variazioni del Mg intracellulare sono rapidamente indotte e si mantengono nel tempo. È stato dimostrato che l’attività di TRPM-7 è regolata dal cAMP e dall’attivazione della proteina chinasi A (Penner, 2007). Intendiamo quindi trattare le HUVEC geneticamente modificate con la forscolina, che attiva la proteina chinasi A, e valutare il Mg intracellulare. Recentemente è stato dimostrato in cellule epiteliali che lo shear stress aumenta l’attività di TRPM-7 (Numata, 2007). È nota l’importanza dello shear stress nel modellamento dei vasi e nella funzionalità endoteliale. In particolare, lo shear stress laminare promuove la quiescenza mentre lo shear stress oscillatorio promuove disfunzioni e turn-over endoteliale. In base al progresso dei nostri esperimenti e al tempo a disposizione, si valuterà la possibilità di sottoporre le nostre cellule a shear stress laminare (15 dyn/cm2) o oscillatorio (+/-5 dyn/cm2) per 24 h (Tressel, 2007) per studiare poi il Mg intracellulare come sopramenzionato. Questi studi ci permetteranno di capire il ruolo di TRPM-7 nell’omeostasi del Mg in cellule endoteliali e sono preliminari agli studi mediante metodologie avanzate di imaging a raggi X, che saranno descritti nella fase III. In particolare, gli esperimenti condotti sulle cellule trasfettate con il mutante di delezione del domain chinasico di TRPM-7 chiariranno se questa attività chinasica è o meno necessaria per regolare i flussi di Mg.
ii) Sarà necessario studiare il comportamento di cellule che esprimano vari livelli di TRPM-7. Gli studi saranno condotti anche sulle cellule trasfettate con il mutante di delezione del domain chinasico. Inizieremo con il valutare la proliferazione cellulare. A intervalli regolari e per almeno un mese, conteremo mediante un cell counter le nostre cellule coltivate come descritto. Si analizzerà anche la loro distribuzione nelle varie fasi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria a flusso (FACS). Alla luce di risultati precedenti (Maier, 2004; Bernardini 2005; Ferré, 2007), studieremo l’espressione di cicline, chinasi ciclino-dipendenti e loro inibitori mediante western blot. In parallelo, verranno condotti esperimenti per comprendere se viene modulato il tasso di apoptosi, valutando i siti internucleosomali per mezzo di elettroforesi su gel di agarosio e, in parallelo, misurando il DNA a basso peso molecolare con metodo fluorimetrico. Inoltre, l'attività delle caspasi sarà valutata mediante kit spettrofotometrici disponibili in commercio.
Dato che una disfunzione endoteliale è associata a molte malattie cardiovascolari tra cui aterosclerosi e ipertensione, studieremo una serie di parametri indicatori della funzionalità delle nostre cellule con particolare attenzione a quei marker che vengono dosati nell’uomo quali indice di disfunzione endoteliale, i.e. ossido nitrico, prostaciclina, citochine e molecole di adesione (Félétou, 2006). Dato che HUVEC in basso Mg producono meno ossido nitrico (NO), importante vasodilatatore implicato nel mantenimento del tono vasale, nelle cellule geneticamente modificate per TRPM-7 studieremo l’espressione delle NO sintetasi (NOS) endoteliale e inducibile mediante Northern e western blot, e l’attività enzimatica misurando la conversione da arginina a citrullina. Studieremo anche l’eventuale modulazione della sintesi di prostacicline mediante ELISA e l’espressione della cicloossigenasi 2, enzima tappa limitante nella sintesi di queste molecole, mediante western blot. Uno degli eventi più precoci nell’aterogenesi è l’adesione dei monociti all’endotelio. Studieremo, pertanto, se diversi livelli di TRPM-7 modulano l’interazione tra i due tipi di cellule. Monociti isolati dal sangue di donatori saranno marcati con il cromo, incubati su un monolayer delle nostre cellule per vari tempi e, dopo vari lavaggi, verrà misurato il grado di interazione endotelio-monociti (Maier, 2004). In caso di modulazione dell’adesività, cercheremo di individuare le molecole di adesione coinvolte (VCAM, ICAM, E- e P- selectina) mediante western blot o FACS. Dato che 1) basso Mg induce la sintesi di citochine pro-infiammatorie in vivo e in vitro e 2) le cellule endoteliali sintetizzano molte citochine, studieremo il profilo del network citochinico nelle cellule ingegnerizzate per TRPM-7 mediante protein array, una metodica molto efficace e già applicata con successo in laboratorio, che consente la determinazione simultanea di molte citochine. In breve, i protein array consistono in membrane su cui sono stati immobilizzati, in doppio, anticorpi diretti contro citochine, chemochine e fattori di crescita. Le membrane saranno quindi incubate con gli estratti cellulari o con i medium di coltura delle nostre cellule. Eventuali differenze di profilo proteico saranno visualizzate mediante chemiluminescenza. I risultati ottenuti saranno poi validati mediante western blot e/o ELISA.
Abbiamo recentemente dimostrato che basso magnesio extracellulare induce PPARgamma, che ha un ruolo cruciale nell’aterogenesi. Proponiamo pertanto di ripetere questi esperimenti anche sulle cellule ingegnerizzate per TRPM-7. Dapprima valuteremo la quantità di PPARgamma mediante western blot. Per studiarne l’attività trascrizionale, trasfetteremo transientemente le cellule con un plasmide contenente la luciferasi come gene reporter sotto il controllo di un promotore artificiale ottenuto per fusione di 4 sequenze consensus per PPARgamma. Il costrutto è stato precedentemente generato e utilizzato nel nostro laboratorio (Leidi, ms in preparazione). Analizzeremo quindi l’attivazione trascrizionale PPARgamma-dipendente misurando l’attività luciferasica. Questi studi descriveranno il ruolo funzionale di TRPM-7 nelle cellule endoteliali. Inoltre, ci permetteranno di correlare la funzionalità endoteliale con i livelli di espressione di TRPM-7 e, alla luce dei dati ottenuti con le diverse tecniche di imaging, con la concentrazione e la distribuzione del Mg intracellulare.
Fase III (mesi 12-24). Le cellule ingegnerizzate per TRPM-7 saranno analizzate mediante metodiche avanzate di imaging ai raggi X in collaborazione con l’U.O. del CNR. Le metodologie di fissazione per la preparazione delle cellule per la microscopia Xray prevedono l'utilizzo di alcoli puri o in opportune miscele a bassissima temperatura. Alla luce dei risultati ottenuti dall’U.O di Roma su linee epiteliali, si valuteranno i metodi più adatti alle nostre cellule. Discorso analogo vale per l’individuazione dei supporti visto che i normali vetrini non possono essere utilizzati in quanto troppo assorbenti per la radiazione. Una volta ottimizzata la preparazione dei campioni, essi saranno esaminati dalla U.O. del CNR. Questi studi ci daranno informazioni relative all’omeostasi del Mg correlabili all’espressione di TRPM-7.

La fattibilità del progetto, per quanto concerne gli studi sull’endotelio, è attestata dal fatto che le tecniche descritte sono già in uso. Inoltre, le persone dell’U.O di Milano coinvolte nel progetto posseggono le competenze necessarie per eseguire gli esperimenti proposti e il laboratorio è attrezzato per consentirne l’attività. La stretta collaborazione con le altre unità operative ci consentirà di raggiungere gli ambiziosi obiettivi di questo progetto.