RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

TECNICHE AVANZATE DI IMAGING MOLECOLARE ED INGEGNERIA GENETICA PER LO STUDIO DELLA DISTRIBUZIONE E DELLA DINAMICA DEL MAGNESIO CELLULARE: NUOVI APPROCCI PER ASSOCIARE LA OMEOSTASI DEL MAGNESIO CON LE FUNZIONI CELLULARI.

Università di riferimento

Consiglio Nazionale delle Ricerche - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Stefano Lagomarsino

Descrizione

L’attività prevista dall’ U.O. del CNR ha come obiettivo principale lo sviluppo di metodologie di microfluorescenza e microimaging con raggi X e l’analisi, con tali metodologie, di campioni selezionati, allo scopo di fornire informazioni sulla distribuzione intracellulare del Mg complementari a quelle ottenibili con le altre tecniche di imaging molecolare proposte in questo progetto.
E’ importante sottolineare che l’applicazione delle tecniche di microimaging e microfluorescenza con raggi X allo studio di sistemi cellulari é piuttosto recente, come si puo’ evincere dalla letteratura riportata. Inoltre, gli esempi citati in letteratura si riferiscono generalmente ad elementi più pesanti, quali il Cu e il Fe, sicuramente di più facile identificazione rispetto al Mg. Infatti la bassa energia della soglia di assorbimento del Mg (1.3 KeV) introduce difficoltà tecniche non trascurabili quali: basso fluorescence yield (rapporto tra fotoni di fluorescenza ed elettroni Auger emessi per un evento di fotoassorbimento) ed elevato assorbimento della radiazione di questa energia da parte dell’aria, del supporto e delle eventuali finestre di camere da vuoto. Tutto ciò quindi richiede un’attenta valutazione ed ottimizzazione delle condizioni sperimentali. D’altra parte la messa a punto di queste metodologie ha una notevole potenzialità non solo per lo studio della distribuzione del Mg; infatti può essere estesa ad altri elementi a basso peso atomico, essenziali alle funzioni della cellula, quali Na e K, la cui distribuzione spaziale e la dinamica intracellulare rappresentano tutt'ora un campo inesplorato. I risultati attesi sono quindi duplici: da un lato la messa a punto di protocolli sperimentali e di analisi dati per il problema generale della localizzazione, della quantificazione e dello stato di ossidazione di elementi nell’ambiente cellulare, e dall’altro lo specifico problema della localizzazione sub-cellulare del Mg, che verrà affrontato nel progetto complessivo con l’apporto di diverse tecniche sperimentali, anche molto diverse tra loro, la cui concorrenza consentirà una validazione reciproca e fornirà gli elementi per una comprensione più approfondita della omeostasi cellulare del Mg.
Le tecniche che si utilizzeranno nell’ambito dell’ U.O. saranno:

1. Microfluorescenza X. Il fascio incidente verrà focalizzato con opportune ottiche (in genere Fresnel Zone Plates) a dimensioni sub-micrometriche (dell’ordine di poche centinaia di nm), quindi verrà effettuato uno scan del campione, e per ogni punto si misurerà sia l’intensità trasmessa con un rivelatore bi-dimensionale, sia lo spettro di fluorescenza mediante un rivelatore a stato solido in grado di discriminare l’energia dei fotoni di fluorescenza. L’intensità trasmessa fornirà l’immagine della cellula in esame, con il contrasto dovuto alla differenza di assorbimento da parte delle differenti zone della cellula, mentre lo spettro di fluorescenza fornirà la distribuzione spaziale degli elementi eccitati, che per una radiazione incidente di 2 keV saranno essenzialmente il Na e il Mg. Sarà quindi possibile determinare anche la co-localizzazione del Na e del Mg.
2. Assorbimento differenziale. Il coefficiente di assorbimento fotoelettrico, nella regione dei raggi X, per qualsiasi elemento diminuisce all’aumentare dell’energia E dei fotoni incidenti, con un andamento inversamente proporzionale al cubo di E, ma in vicinanza della soglia di assorbimento aumenta bruscamente con una variazione anche maggiore di 10 volte. Per il Mg, la cui soglia di assorbimento è a 1300 eV, il coefficiente di assorbimento passa da circa 447 cm2/g per un’energia di 1295 eV a circa 5914 cm2/g per 1305 eV. In questo picccolo intervallo di energia il coefficiente di assorbimento degli altri elementi è praticamente costante. Sottraendo quindi le due immagini, prese ad es. alle due energie a cavallo della soglia prima indicate, si otterrà un contrasto dovuto solo alla presenza del Mg, da cui si ricaverà quindi la distribuzione del Mg nei vari comparti cellulari. Valutazioni preliminari confermano che il contrasto dovuto alla presenza di Mg sarà apprezzabile. Questo tipo di metodologia verrà implementato con due diverse tecniche sperimentali: imaging con l’utilizzo di lenti e imaging senza lenti.
a) Imaging con utilizzo di lenti: in questo caso verrà utilizzato un microscopio per raggi X “full field”, in cui, in analogia con un microscopio ottico, l’immagine del campione viene proiettata nel piano del rivelatore (in generale una camera CCD per raggi X, dotata di uno scintillatore e di opportune ottiche), con ingrandimenti dell’ordine di 100x o più. La risoluzione spaziale ottenibile è dell’ordine di qualche decina di nm.
b) Imaging senza lenti: è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione anche con un set-up senza lenti, utilizzando una geometria a contatto ed un opportuno detector bi-dimensionale ad alta risoluzione. Quest’ultimo puo’ essere realizzato con un detector basato su film di LiF (vedi R.M. Montereali, in Handbook of thin film materials, Vol 3, ch. 7 Ed. H.S. Nalwa (2002) and S. Almaviva et al., Appl. Phys. Lett., 89, 054102 (2006)). In questo caso, la radiazione X produce dei difetti cristallini puntuali, detti centri di colore, che luminescono quando sono eccitati da una radiazione visibile di lunghezza d’onda dell’ordine di 450 nm. La decodificazione dell’immagine avviene quindi mediante un microscopio confocale a fluorescenza, con una risoluzione spaziale dell’ordine di 250-300 nm. Poichè la produzione dei centri di colore è proporzionale all’intensità della radiazione che incide sul film di LiF, è possibile registrare le variazioni spaziali dell’intensità trasmessa dal campione (nel nostro caso la cellula). Anche in questo caso verranno registrate due immagini a due differenti energie, una subito prima ed una subito dopo la soglia di assorbimento. Le due immagini verranno registrate per due differenti posizioni del detector, in modo da non sovrapporle. Queste verranno quindi lette con il microscopio confocale, e sottratte opportunamente l’una dall’altra in modo da mettere in evidenza le zone dove il Mg e’ presente.
L’assorbimento differenziale, in entrambe le forme, permette anche, in linea di principio, di distinguere tra diversi stati di valenza. Infatti l’energia di legame del livello energetico 1s, responsabile dell’assorbimento a 1300 eV, risente del legame chimico dell’elemento. Quindi la soglia di assorbimento del Mg per diversi stati di ossidazione può variare anche di qualche eV. Registrando immagini a diverse energie incidenti dovrebbe essere possibile distinguere tra il Mg libero e quello legato. Il condizionale è dovuto alla scarsa conoscenza di come il Mg si lega effettivamente, a livello chimico, alle varie componenti cellulari, e conseguentemente alle variazioni nell’energia di soglia, e della reale distribuzione spaziale e separazione tra Mg libero e Mg legato, che potrebbe non essere significativa al punto tale da consentirne la rivelazione con le tecniche proposte. In ogni caso abbiamo la speranza che le tecniche indicate possano anche dare qualche informazione su questi aspetti.

Tutte le modalità sperimentali sopra descritte verranno implementate, utilizzando diverse facilities di radiazione di sincrotrone, in particolare la beamline di microscopia X ID21 presso la European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) di Grenoble, la linea TWINMIC presso Elettra a Trieste, e la linea di UV e soft x-rays presso DAFNE a Frascati.
Presso l’ ESRF si effettueranno misure di microfluorescenza, utilizzando l’apparecchiatura di STXM (Scanning Transmission X-ray Microscope) e un rivelatore a stato solido al Ge per la misura di fluorescenza. L’energia incidente sarà di 2 KeV, la risoluzione spaziale di circa 0.3x0.6 microns.
Presso la linea TWINMIC di Elettra si effettueranno misure di microscopia “full field “ utilizzando Fresnel Zone Plates per una risoluzione spaziale dell’ordine di 60 nm. Diverse immagini verranno acquisite intorno alla soglia di assorbimento di 1300 eV, per misure di assorbimento differenziale e, sperabilmente, per mettere in evidenza diverse distribuzioni spaziali per il Mg libero e quello legato.
Presso la linea UV e soft x-rays di DAFNE verranno invece effettuate misure di assorbimento utilizzando film di LiF come rivelatore a contatto ad alta risoluzione spaziale. Anche in questo caso verranno registrate immagini a diverse energie intorno alla soglia di 1300 eV.

In tutti i casi citati, sarà essenziale mettere a punto tecniche di deposizione e di fissaggio delle cellule su opportuni substrati. Infatti i normali vetrini non possono essere utilizzati in quanto troppo assorbenti per la radiazione che si utlizzerà. In letteratura vengono citati substrati quali le griglie per la microscopia elettronica coperte da film di Formvar, o substrati di Si con finestre sottilissime di Si3N4. Inoltre non potranno essere esaminate cellule vive, a causa del danneggiamento da radiazione che rischierebbe di alterare la conformazione e la funzionalità della cellula. Sarà quindi necessario mettere a punto protocolli per il fissaggio delle cellule che ne permettano l’esame con le tecniche proposte. Anche in questo caso vi sono esempi in letteratura che però dovranno essere provati ed ottimizzati per le specifiche esigenze del progetto.
Un altro aspetto importante da considerare è la necessità di confrontare i risultati ottenuti utilizzando le metodiche a raggi X, con quelli ottenuti utilizzando le sonde fluorescenti. A questo scopo sarà necessario usare portacampioni che potranno essere posti sia nelle apparecchiature a raggi X sia nel microscopio confocale, e poter disporre di punti di riferimento precisi, in modo da poter individuare le singole cellule esaminate con le due tecniche. Questo sarà reso possibile da opportuni markers realizzati con tecniche di microfabbricazione presenti presso l’ U.O.

Per quanto riguarda la scansione temporale, si seguirà il seguente workplan:
nei primi sei mesi del progetto si metteranno a punto i protocolli di preparazione e di fissaggio delle cellule in collaborazione con le U.O di Roma e Milano, e le metodiche di preparazione dei substrati. Riguardo a questo aspetto verranno prese in considerazione le differenti caratteristiche dei diversi esperimenti, per ognuno dei quali si cercheranno le soluzioni ottimali. Utilizzando la facility di microfabbricazione dell’ IFN verranno effettuati markers opportuni sui substrati (dots di oro o di altro materiale adatto) per l’identificazione delle cellule in esame.
Nei successivi dodici mesi verranno effettuati gli esperimenti presso le facilities sopra descritte, utilizzando le cellule HC11 messe a punto dall’ U.O. di Roma. Verranno confrontate le risposte da cellule basali e stimolate, secondo quanto descritto dalle U.O di Roma, e da cellule marcate e non marcate con le sonde fluorescenti. I risultati verranno poi comparati con quelli ottenuti da misure di microscopia confocale e spettrofluorimetria presso rispettivamente le U.O di Roma e Bologna.
Negli ultimi sei mesi si studieranno invece prevalentemente le linee cellulari messe a punto dall’U.O di Milano geneticamente modificate per l’espressione dei canali per il Mg.

Nel loro insieme le attività svolte dalle diverse U.O., caratterizzate da competenze complementari, consentiranno di mettere a punto, per la prima volta in Italia, un sistema coerente di protocolli sperimentali di imaging molecolare ad altissima risoluzione spaziale (dell'ordine di 100 nm) per la determinazione della distribuzione spaziale intracellulare di elementi essenziali alle funzioni della cellula, portando un contributo metodologico e cognitivo di avanguardia.