RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

DINAMICA DELL'INTERAZIONE RIBOSOMI-LIGANDI DURANTE L'INIZIO DELLA TRADUZIONE NEI BATTERI E NEGLI ARCHEI

Università di riferimento

Università degli Studi di CAMERINO - BIOLOGIA MOLECOLARE, CELLULARE E ANIMALE - ()

Responsabile dell'Unità di ricerca

Claudio Gualerzi

Descrizione

Questo programma di ricerca si prefigge di studiare, mediante chemical probing time-resolved e mediante analisi cinetiche transienti, le tempistiche nonchè vari aspetti meccanicistici e dinamici di alcuni passaggi elementari che conducono alla formazione dei complessi d’inizio 30S e 70S. Questi metodi ci consentiranno di individuare gli intermedi di reazione e di determinare le costanti cinetiche della loro formazione e dissociazione o trasformazione in altri tipi di intermedi. Dopo aver generato tutta una serie di derivati fluorescenti di tutti i ligandi ribosomali d’interesse (IF1, IF2, IF3, fMet-tRNA, mRNA) nonché dei ribosomi stessi saremo in grado di analizzare le cinetiche delle varie reazioni utilizzando apparati “quench-flow” e “stopped-flow” medianti i quali le reazioni verranno seguite in tempo reale, utilizzando come osservabili cambiamenti di intensità di fluorescenza e di altri parametri modificati in conseguenza delle interazioni fra ligandi ribosomali. Di particolare rilevanza a questo riguardo sono gli esperimenti nei quali non analizzeremo la fluorescenza emessa da un singolo fluoroforo legato ad una macromolecola d’interesse, bensì la fluorescenza emessa a seguito di trasferimento di energia tra un fluoroforo donatore presente su di un ligando ribosomale ed un fluoroforo accettore presente su di un altro ligando. Questo tipo di approccio, sfruttando coppie diverse di ligandi marcati offre una gamma pressochè illimitata di possibilità di analizzare i meccanismi di varie reazioni e di stabilire la eventuale contemporanea presenza di due ligandi diversi (ad es. IF3 ed fMet-tRNA) sulla stessa subunità ribosomale 30S, permettendoci così di rispondere a tutta una serie di quesiti rimasti sinora irrisolti (ad es. se IF3 venga o meno espulso dalla subunità 30S quando quest’ultima lega il tRNA d’inizio). In ultima analisi, gli esperimenti che ci proponiamo di condurre con ligandi ribosomali resi fluorescenti in specifiche posizioni e con diversi fluorofori mediante le tecniche descritte in maggior dettaglio nella versione inglese di questo programma, ci consentiranno di misurare direttamente le costanti cinetiche di associazione e dissociazione di ciascun componente dei complessi d’inizio della traduzione, di trovare risposte empiriche a tutti i quesiti che restano aperti (ad es. se IF2 sia o meno un “carrier” del tRNA d’inizio, o quale sia la fase del processo d’inizio in cui viene dissociato IF1 ecc.). I risutati pttenuti dovrebbero infine permetterci di costruire uno schema cinetico dell’intero processo d’inizio che sia compatibile con tutti i dati sperimentali e permetta di comprendere le basi cinetiche di fenomeni di estremo interesse quali ad es. la funzione di “controllore della fedeltà della selezione del sito d’inizio” operato da IF3.
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