RICERCA ITALIANA     

Studio dell'omeostasi del magnesio in patologie associate a difetti primari e secondari del metabolismo ionico

Università degli Studi di Bologna

Abstract

I meccanismi dell'omeostasi del magnesio nei diversi tessuti hanno ancora molti punti incogniti. Molti studi riportano dati riferiti alla concentrazione sierica di magnesio totale, quando è noto che è la concentrazione della frazione libera intracellulare quella funzionalmente importante. Questo progetto di ricerca intende contribuire alla conoscenza dei meccanismi di regolazione dell'omeostasi del magnesio valutando la sua distribuzione in diversi tessuti dell'uomo, misurando la concentrazione della frazione libera intracellulare (Mg2+) nel muscolo, nel cervello, nelle cellule ematiche (eritrociti, linfociti, piastrine) e la concentrazione totale e libera nel plasma. Saranno utilizzate tecniche analitiche specifiche a seconda della tipologia cellulare, in particolare: con la spettroscopia di risonanza magnetica del fosforo (31P MRS) si misurerà direttamente in vivo la concentrazione intracellulare nel muscolo scheletrico e nel cervello, con tecniche fluorimetriche e citofluorimetriche la concentrazione intracellulare nelle cellule ematiche, con assorbimento atomico la concentrazione totale e con elettrodo iono-sensibile la concentrazione della frazione libera nel plasma. E' noto che variazioni del contenuto intracellulare del Mg2+ libero sono presenti in molte situazioni patologiche. Queste possono
essere suddivise in due grandi gruppi: a) patologie associate ad un difetto primario del metabolismo ionico, quindi che interessano direttamente i sistemi di trasporto come le canalopatie, b) patologie associate ad un difetto secondario del metabolismo ionico che interessano o la regolazione ormonale o difetti di assorbimento. Questo progetto di ricerca intende utilizzare patologie che rappresentano modelli sperimentali in vivo adeguati per lo studio della omeostasi del Mg e per le quali esiste un interesse clinico per la valutazione funzionale del deficit di questo ione.
Le patologie selezionate per questo progetto sono:
a) sindrome LQT che è uno squilibrio della ripolarizzazione cardiaca causato da un difetto genetico associato a mutazioni del gene HERG che alterano il funzionamento del canale per il potassio e per i quali bassi livelli di Mg serico con alti livelli di ritenzione di Mg sono ricorrenti;
b) insufficienza intestinale cronica benigna (IICB) in cui le cause principali di deficit di magnesio sono il ridotto apporto alimentare ed il malassorbimento; c) iperaldosteronismo primario e secondario dove il deficit di magnesio intracellulare è legato all'azione stimolatoria dell'aldosterone sul trasportatore di membrana Na+-Mg2+.
I risultati ottenibili da questo progetto consentiranno di ottenere un quadro articolato della distribuzione del magnesio nei diversi tessuti sia nei soggetti sani che nei pazienti e acquisire informazioni sui meccanismi che ne regolano l'omeostasi.
L'analisi della distribuzione tissutale del magnesio nelle singole patologie fornirà inoltre preziose indicazioni sull'opportunità di somministrare magnesio come ausilio farmacologico per il trattamento dei pazienti e getterà le basi per progettare eventuali sperimentazioni cliniche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Bruno BARBIROLI Università degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto di ricerca intende contribuire alla conoscenza dei meccanismi di regolazione dell'omeostasi del magnesio
valutando la sua distribuzione in diversi tessuti dell'uomo, misurando la concentrazione della frazione libera intracellulare (Mg2+) nel muscolo, nel cervello, nelle cellule ematiche (eritrociti, linfociti, piastrine) e la concentrazione totale e libera nel plasma. Saranno utilizzate tecniche analitiche specifiche a seconda della tipologia cellulare, in particolare: con la spettroscopia di risonanza magnetica del fosforo (31P MRS) si misurerà direttamente in vivo la concentrazione intracellulare nel muscolo scheletrico e nel cervello, con tecniche fluorimetriche e citofluorimetriche la concentrazione intracellulare nelle cellule ematiche, con assorbimento atomico la concentrazione totale e con elettrodo iono-sensibile la concentrazione della frazione libera nel plasma. Saranno esaminate patologie che rappresentano modelli sperimentali in vivo adeguati per lo studio della omeostasi del magnesio e per le quali esiste un interesse clinico per la valutazione funzionale del deficit di questo ione. Saranno pertanto esaminati 14 pazienti affetti da sindrome LQT inviati dall'unità di ricerca del Dipartimento di Scienze Biochimiche, Fisiologiche e della Nutrizione dell'Università di Messina, 23 affetti da aldosteronismo primario o secondario inviati dall'unità di ricerca del Dipartimento di Biomedica e Scienze Chirurgiche dell'Università di Verona, 12 da insufficienza intestinale cronica benigna inviati dall'unità di ricerca di Medicina Interna, Centro Regionale di Riferimento per Insufficienza Intestinale Cronica Benigna dell' Università di Bologna e 50 volontari sani paragonabili per sesso e per età a quella dei pazienti, reclutati dall'unità di ricerca del "Dipartimento di Medicina Clinica e Biotecnologia Applicata dell'Università di Bologna", che verranno utilizzati come controlli.
Gli obiettivi specifici del programma sono:
1) Definire le concentrazioni di magnesio nei diversi tessuti in pazienti affetti da sindrome LQT al fine di valutare se il deficit di Mg2+ rappresenta un cofattore significativo nello scatenamento di aritmie ventricolari e sincopi tipiche di questa patologia. 2) Definire la concentrazione di magnesio nei diversi tessuti in pazienti affetti da aldosteronismo primario e secondario per verificare se la già descritta carenza linfocitaria nell'aldosteronismo primario è presente anche nell'aldosteronismo secondario ed è estesa anche ad altre tipologie cellulari.
3) Definire la concentrazione di magnesio nei diversi tessuti in pazienti affetti da insufficienza intestinale cronica benigna allo scopo di valutare sia le relazioni tra le concentrazioni di Mg libero intracellulare e i potenziali meccanismi eziopatogenetici di deficit di Mg di questa patologia, che le potenziali conseguenze fisiopatologiche del deficit di Mg sullo stato di nutrizione del potassio e sulla funzionalità del paratormone.
4) Ottenere un quadro articolato della distribuzione nei diversi tessuti di questo ione correlando le concentrazioni di Mg2+ del cervello, del muscolo scheletrico ,di linfociti, eritrociti, piastrine e del plasma, ottenute in soggetti sani;
5) Ottenere informazioni sui meccanismi di regolazione di questo ione nei diversi tessuti confrontando la distribuzione tissutale di Mg2+ dei soggetti sani con quella dei pazienti.
6) Definire metodiche analitiche di citofluorimetria a flusso confrontando i risultati ottenuti con quelli acquisiti da misure
spettrofotometriche classiche effettuate secondo metodiche di routine.
7) Validare dal punto di vista clinico la spettroscopia di risonanza magnetica del fosforo per la valutazione in vivo della
concentrazione della frazione libera intracellulare di magnesio. <<<

Risultati parziali attesi

Eseguita la prima tranche di esami 31P MRS e acquisiti i risultati analitici relativi a questi campioni si inizierà la compilazione di un database per i soggetti esaminati che consentirà di ottenere una prima indicazione della distribuzione nei diversi tessuti di questo ione. In questa fase si completerà lo studio dei pazienti affetti da aldosteronismo primario.
La valutazione combinata ottenibile dalla 31P MRS della concentrazione della frazione libera intracellulare di magnesio del muscolo scheletrico in diverse condizioni metaboliche e della velocità di risintesi della fosfocreatina dopo esercizio muscolare, nei soggetti sani e nei pazienti, fornirà indicazioni sull'influenza del magnesio sulla funzionalità mitocondriale muscolare. Dal confronto dei dati acquisiti con metodiche analitiche di citofluorimetria a flusso con quelli acquisiti da misure spettrofotometriche classiche, si potranno ottenere utili indicazioni per la caratterizzazione funzionale dei campioni in esame e per la messa a punto di protocolli di indagine citofluorimetrica.Completati tutti gli esami 31P MRS e acquisiti tutti i risultati analitici si compilerà il database complessivo per tutti i soggetti esaminati che consentirà di ottenere un quadro articolato della distribuzione del magnesio nei diversi tessuti sia nei soggetti sani che nei pazienti e acquisire informazioni sui meccanismi che ne regolano l'omeostasi.
L'analisi della distribuzione tissutale del magnesio nelle singole patologie fornirà inoltre preziose indicazioni sull'opportunità di somministrare magnesio come ausilio farmacologico per il trattamento dei pazienti e getterà le basi per progettare eventuali sperimentazioni cliniche. Sulla base dei dati acquisiti con metodiche analitiche di citofluorimetria a flusso e spettrofotometria si potrà infine stabilire l'applicabilità dei protocolli proposti alle diverse patologie e ai diversi campioni cellulari. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il Magnesio e' uno dei cationi più abbondanti nelle cellule dei tessuti molli, raggiungendo in molti di essi concentrazioni che oscillano tra 14 e 20 mM (1). E' noto che il Magnesio è coinvolto in numerosi processi cellulari, quali: sistemi di trasporto, sistemi recettoriali, trasduzione di segnali, attività di diversi enzimi, metabolismo energetico, sintesi di DNA e proteine, mantenimento delle corrette funzioni delle membrane (1,2). Il fatto che la sua concentrazione intracellulare sia relativamente alta e le fluttuazioni relativamente limitate, ha fatto ipotizzare che questo ione possa agire come un regolatore a lungo termine per gli enzimi e le funzioni cellulari (1,2). La sua concentrazione cellulare è funzione sia del gradiente positivo intra-extra cellulare che ne controlla l'influsso, che di meccanismi di trasporto che ne regolano l'efflusso, costituiti principalmente da trasportatori che scambiano Na+/Mg2+ (1). Recentemente sono stati identificati nuovi canali, espressi prevalentemente nel tessuto dell'epitelio intestinale, appartenenti alla famiglia TRP (Transient Receptor Potential), quali TRPM6 e TRPM7, che mostrano un coinvolgimento nella omeostasi del magnesio(3,4). Tuttavia rimangono ancora molti punti incogniti sui meccanismi dell'omeostasi del magnesio nei diversi tessuti. Molti studi riportano dati riferiti alla concentrazione sierica di magnesio totale, ma vi sono crescenti evidenze che è la concentrazione della frazione libera intracellulare quella funzionalmente importante (5-8). Il magnesio è stato anche definito come lo ione dimenticato in quanto, pur rappresentando quantitativamente il secondo ione intracellulare dopo il potassio, viene raramente considerato nella pratica medica (9). La scarsità dei dati in letteratura riguardanti il suo ruolo nella cellula ed il suo meccanismo di regolazione è dovuta principalmente alle difficoltà analitiche insite nella determinazione della frazione libera intracellulare che è la quota biologicamente attiva, di conseguenza la grande maggioranza dei lavori scientifici si è focalizzata sulla determinazione del magnesio plasmatico che rappresenta meno dell'1% del magnesio totale con ovvie conseguenti limitazioni interpretative. Tuttavia, la misura della frazione libera intracellulare può essere effettuata in diversi tessuti con diverse metodiche, come l'utilizzo di microelettrodi iono-selettivi (10), spettroscopia di risonanza magnetica del fosforo (31P MRS) (11-13), spettroscopia di fluorescenza (14). Tutte queste metodiche presentano diversi campi di applicazione, a seconda dei tipi cellulari indagati, rappresentando pertanto un approccio analitico che richiede competenze, risorse strumentali e protocolli sperimentali adeguati. Uno degli aspetti che sono maggiormente al centro dell'attenzione dei ricercatori riguarda i meccanismi cellulari capaci di mantenere relativamente costante la concentrazione intracellulare di magnesio nonostante il gradiente transmembrana rivolto verso l'interno della cellula. Inoltre, un grande interesse è rivolto allo studio degli ormoni coinvolti nella regolazione dell'omeostasi cellulare del magnesio, che appare influenzata dalle catecolamine(15-17) , insulina (18), aldosterone (16, 19) e dalla concentrazione extracellulare di glucosio (20).
Romani e Scarpa (15-17) infatti hanno dimostrato che le amine simpaticomimetiche agiscono sulla cellula producendo un'attivazione dell'adenilato ciclasi ed un aumento dell' AMPc cui consegue un'attivazione dello scambiatore Na +/Mg2+ della membrana plasmatica e conseguente diminuzione della concentrazione del magnesio totale cellulare. Inoltre, gli stessi autori hanno mostrato che l'insulina è in grado di bloccare l'effetto delle catecolamine sul magnesio intracellulare. E' noto che variazioni del contenuto intracellulare del Mg2+ libero sono presenti in molte situazioni patologiche (5,8,18-32). Queste possono essere suddivise in due grandi gruppi: a) patologie associate ad un difetto primario del metabolismo ionico, quindi che interessano direttamente i sistemi di trasporto come le canalopatie, b) patologie associate ad un difetto secondario del metabolismo ionico che interessano o la regolazione ormonale o difetti di assorbimento. Questo progetto di ricerca intende utilizzare patologie che rappresentano modelli sperimentali in vivo adeguati per lo studio della omeostasi del Mg e per le quali esiste un interesse clinico per la valutazione funzionale del deficit di questo ione.
Le patologie selezionate per questo progetto sono:
a) sindrome LQT, che è uno squilibrio della ripolarizzazione cardiaca, congenito o acquisito, associato a mutazioni nei geni codificanti per i canali ionici. Tra queste, quella del gene HERG provoca un'alterazione del funzionamento del canale per il potassio, a causa della quale sono ricorrenti bassi livelli di Mg serico con alti livelli di ritenzione di Mg (21-24);
b) insufficienza intestinale cronica benigna (IICB) in cui le cause principali di deficit di magnesio sono il ridotto apporto alimentare ed il malassorbimento (25-27);
c) iperaldosteronismo primario e secondario dove il deficit di magnesio intracellulare è legato all'azione stimolatoria
dell'aldosterone sul trasportatore di membrana Na+-Mg2+ (28-31).

Ruolo del Mg2+ nella sindrome LQT
Dati sperimentali e clinici suggeriscono che il deficit di Mg2+ può portare ad un aumento della concentrazione del Ca2+
intracellulare, alla formazione di ROS, agenti pro-infiammatori, modificazioni dei livelli dei fattori di crescita, e a cambiamenti nella permeabilità di membrana e nei processi di trasporto nelle cellule cardiache. Gli effetti opposti di Mg2+ e Ca2+ sulla contrattilità cardiaca potrebbero dipendere dalla competizione tra i due ioni per gli stessi siti di legame su proteine chiave nel processo di contrazione, quali troponina C, miosina e actina (32). L'azione di stimolanti, ad esempio le catecolamine, può provocare un forte efflusso di Mg2+ che sembra indurre un aumento nella forza di contrazione del cuore. Questo efflusso potrebbe essere legato al sistema di trasmissione del segnale mediato dal Ca2+ (33). L'ipomagnesemia è anche comunemente associata con l'ipocaliemia, ed è presente in pazienti con ipertensione o infarto miocardico, e negli alcolisti cronici (34). Il deficit di potassio è associato con un aumento dell'escrezione urinaria di magnesio, calcio e fosfato negli stati ipertensivi. Infatti, l'ipocaliemia insieme ad aumentata caliuresi sono evidenti in un numero significativo di pazienti ipomagnesemici. In caso di grave deficit di Mg2+ si possono registrare cambiamenti nell'ECG, con alterazioni dell'onda-T, del segmento QT, e degli intervalli PR e QRS. I cambiamenti
nell'ECG possono essere secondari all'ipocaliemia associata al deficit di Mg2+(34). Nell'ambito delle alterazioni
elettrocardiografiche si inserisce la sindrome del QT lungo (LQTS), che consiste in un lungo intervallo QT nell'ECG, e in episodi di aritmia ventricolare in seguito a stress emotivo o fisico. La sindrome LQT è di due tipi, congenita o acquisita (35, 36). La causa della sindrome LQT congenita sembra riconducibile a mutazioni a carico dei geni codificanti per i canali ionici del sodio e del potassio presenti nel cuore, con conseguente modificazione delle proteine costituenti i canali. Quattro loci genetici responsabili della malattia sono stati finora identificati con successo sulla base di diagnosi preliminare: geni per il canale del K+, KVLQT1 sul cromosoma 11p15.5, HERG su 7q35-36 e minK su 21q22, e il gene per il canale del Na+ SCN5A sul cromosoma 3p21-24 (35, 37). Di recente, è stato riportato che in pazienti con sindrome LQT congenita, il deficit di magnesio può essere associato con la sincope, mentre la somministrazione di magnesio può prevenire la sincope ricorrente. Pertanto, è possibile ipotizzare che il deficit di Mg2+ può essere identificato come un cofattore significativo in alcune forme di sindrome LQT (24).

Ruolo del Mg2+ insufficienza intestinale cronica benigna (IICB)
L'IICB può essere dovuta a quattro condizioni patologiche (ognuna delle quali può originare da più malattie gastrointestinali): intestino corto, disturbi cronicidella motilità intestinale, fistole intestinali, danni estesi della mucosa intestinale (38). La persistenza di deficit di magnesio (Mg) e potassio (K) (26, 39) e la presenza di alterazioni del metabolismo osseo sono tra le problematiche più diffuse (33, 40). Bassi livelli sierici di Mg e K sono stati osservati nel 2-30% dei pazienti in nutrizione parenterale domiciliare NPD (26, 39). Inoltre, in quasi il 30% di pazienti con livelli sierici di Mg nella norma sono stati osservati bassi livelli di Mg intraeritrocitario (25). La presenza di malattia ossea, valutata con la metodica della densitometria ossea è stata osservata nell'84% dei pazienti adulti con IICB in NPD, circa la metà dei quali, in base ai criteri della Organizzazione Mondiale della Sanità, avevano osteoporosi (40). Il Mg viene assorbito per diffusione passiva a livello del tenue distale e del colon (39); a livello dell'intestino tenue, l'assorbimento è stimolato dall'1,25-diidrossicolecalciferolo (42). Tuttavia, nei pazienti con IICB, il deficit di Mg può causare un deficit di secrezione del paratormone e una sua ridotta azione periferica, che, a livello renale, porta ad una riduzione della produzione di questa molecola (42). In questi pazienti il deficit di Mg può essere causato, oltre che da ridotto apporto alimentare e da malassorbimento, anche da aumento delle perdite attraverso la via renale, dovuto alla presenza di iperaldosteronismo secondario a disidratazione, spesso presente nella IICB (43, 44). Nei pazienti con IICB, il deficit di Mg può avere un ruolo sia nel mantenimento del deficit di K sia nella patogenesi della malattia ossea (45).

Ruolo del Mg2+ nell'iperaldosteronismo primario e secondario
L'iperaldosteronismo primitivo rappresenta un modello interessante per studiare l'omeostasi del magnesio. Si pensa che
l'aldosterone agisca a livello tubulare renale inducendo escrezione di magnesio (43,44). Questo effetto sarebbe secondario
all'espansione di volume e all'ipertensione associata con l'iperaldosteronismo. Horton e Biglieri hanno descritto un'aumentata megnesiuria in pazienti con iperaldosteronismo primitivo (43) tuttavia la maggior parte dei dati in letteratura indica che i livelli plasmatici di magnesio non sono alterati significativamente in pazienti con iperaldosteronismo primitivo (43, 44), mentre la concentrazione intralinfocitaria di magnesio libero, è significativamente ridotta in pazienti con iperaldosteronismo primitivo rispetto ai controlli sani (19). Esistono inoltre segnalazioni di un'aumentata incidenza di ipertensione intracranica idiopatica in pazienti con iperaldosteronismo primitivo (46), tuttavia non esistono ancora dati riguardanti la concentrazione encefalica del magnesio che potrebbero essere forniti da uno studio 31P MRS. Da studi in vitro su linfociti umani si è visto che l'effetto dell'aldosterone sulla concentrazione intracellulare di magnesio appare dose-dipendente con un EC50 approssimativamente di 0,5-1 nmol/l che è un valore vicino alla concentrazione fisiologica di aldosterone nel plasma (19). Questo indica che il ruolo dell'aldosterone sia di regolatore fisiologico della concentrazione intracellulare di magnesio. Infatti, si è inoltre evidenziato che l'aldosterone attiva un
meccanismo di trasporto di membrana Na+-Mg2+ exchanger (19). Quindi è verosimile che l'azione dell'aldosterone si esplichi tramite l'attivazione di tale sistema di trasporto che producendo un efflusso netto di magnesio produrrebbe un decremento della concentrazione intracellulare di magnesio.
Anche l'iperaldosteronismo secondario appare costituire un modello interessante per lo studio del ruolo del magnesio
nell'organismo. Pazienti con insufficienza cardiaca sono caratterizzati da iperaldosteronismo secondario legato prevalentemente all'attivazione adrenergica ed all'iperreninismo conseguente. Il recente studio RALES (45) condotto su 1633 pazienti con scompenso cardiaco ha mostrato come l'aggiunta alla terapia convenzionale di un antagonista dell'aldosterone, lo spironolattone, è accompagnata da una riduzione della mortalità del 30 %. Fra le possibili azioni dello spironolattone vi è quella del risparmio del magnesio anche se tale effetto non è stato specificamente indagato dai ricercatori dello studio RALES. Fra i meccanismi interessati dall'azione di un risparmiatore di magnesio nell'insufficienza cardiaca vi è quello che riguarda la regolazione del turnover del collagene. Esistono infatti interessanti dati sperimentali che suffragano l'ipotesi che una delle principali cause della fibrosi miocardica sia l'aldosterone. Infatti un aumento della concentrazione plasmatica di aldosterone è accompagnato da fibrosi biventricolare nei ratti epuò essere prevenuta dalla somministrazione di spironolattone (48). Infine, gli ACE inibitori anche a dosi non ipotensive prevengono la fibrosi miocardicain cuori sottoposti ad un sovraccarico di pressione (49). Anche se il legame fra omeostasi del magnesio e fibrosi è solo un'ipotesi di lavoro, esistono alcuni lavori che confermano questa teoria. In ratti mantenuti a dieta carente di magnesio si è evidenziato un aumento del contenuto di collagene sia nel cuore che nell'aorta (50,51). E' stato recentemente dimostrato che incubando fibroblasti umani in assenza di magnesio l'espressione dell'mRNA per il collagene I e III
appare aumentata rispetto a cellule incubate con magnesio (52). Sembra quindi possibile ipotizzare che nell'insufficienza cardiaca l'iperaldosteronismo secondario possa, producendo un bilancio negativo del magnesio, indurre un aumento del contenuto di collagene del cuore che contribuirebbe al progressivo deterioramento della funzione miocardica (31). <<<