RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MATRICE EXTRACELLULARE: FENOMENI REGOLATORI, INTERAZIONI INTERMOLECOLARI E MODIFICAZIONI FUNZIONALI

Università di riferimento

Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como - MORFOLOGIA UMANA - VARESE(VA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Mario RASPANTI

Descrizione

La presente Unità di Ricerca ha il compito di ottenere una migliore conoscenza delle interazioni macromolecolari e delle loro implicazioni morfo-funzionali in tessuti sottoposti a differenti requisiti funzionali. Come è evidente dalla base scientifica, le modalità di interazione tra macromolecole della matrice extracellulare sono conosciute solo parzialmente pur essendo di fondamentale importanza per le proprietà funzionali dei vari tessuti connettivi. Una prima parte della ricerca sarà effettuata su tendini soggetti a carico funzionale estremo, che rappresentano una parte integrante della ricerca svolta dall'Unità di Ricerca #1. La stessa Unità fornirà il tendine di Achille di ratti adulti normali esposti a stretching prolungato. I tendini saranno isolati e suddivisi in tre quote. Una prima parte sarà osservata appena possibile mediante microscopia a forza atomica a contatto intermittente in fluido, allo scopo di valutare l'architettura del tessuto in condizioni il più possibile vicine alle condizioni native. La fissazione sarà contenuta a livelli minimi (glutaraldeide 0.1% più paraformaldeide 0.1% in tampone fosfato 0.1M a freddo per 10 minuti), che notoriamente non causano alterazioni alla struttura secondaria o terziarie delle proteine. Gli stessi campioni nelle stesse condizioni saranno osservati al freeze-etching dall'Unità di Ricerca #1. Una seconda parte verrà trattata con colorazioni istochimiche selettive per lo studio della componente proteoglicanica o per le microfibrille collagene tipo VI, come le ftalocianine di rame (cupromeronic blue) in concentrazioni elettrolitiche critiche (CEC) o i composti di rutenio(ruthenium hexammine trichloride), e successivamente disidratati mediante Critical Point Drying o mediante evaporazione da Hexamethyldisilazane. Un'altra parte ancora sarà destinata alla immunolocalizzazione dei vari componenti con opportuni anticorpi coniugati con oro colloidale, allo scopo di identificare la posizione, distribuzione e disposizione spaziale delle stesse macromolecole della matrice. Tutti i campioni saranno metallizzati mediante sputter-coating ed osservati mediante microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione su un Philips XL 30 FEG, oppure osservati senza altri trattamenti mediante Microscopia a Forza Atomica a Contatto Intermittente (Tapping-Mode Atomic Force Microscopy, TMAFM) su un Digital Instruments Multi-Mode Nanoscope IIIA. Entrambe le tecniche, disponibili presso il laboratorio del richiedente, hanno la capacità di risolvere agevolmente singole molecole e di riconoscere i prodotti di reazione delle macromolecole della matrice con i reagenti istochimici usati; la TMAFM consente inoltre di ottenere routinariamente ricostruzioni tridimensionali, animazioni e rendering fotorealistico da viewpoint arbitrarie, mentre analoghe tecniche sono in corso di implementazione per la SEM. Coerentemente con il protocollo sperimentale delle altre unità di ricerca, il tendine della zampa controlaterale non trattata sarà usata come controllo. Un'altra parte della ricerca, non direttamente interessata dalle modificazioni funzionali indotte dallo stress, ha sarà svolta sulle guaine del tendine degli stessi animali. E' noto che le guaine del tendine sono formate da fibrille collagene sottili e uniformi, che corrono circonferenzialmente rispetto all'asse del tendine o che avvolgono il tendine stesso in un reticolo isotropico. A causa della loro disposizione spaziale, e forse anche della loro struttura interna, queste fibrille non sono sottoposte ad uno sforzo tensile significativo e, di conseguenza, pur avendo la stessa sede anatomica dei tendini mostrano un'organizzazione spaziale completamente differente e rappresentano un modello sperimentale completamente diverso. Le guaine del tendine (epitenonio e/o peritenonio) saranno isolate ed analizzate con lo stesso protocollo sperimentale e le stesse tecniche (istochimica, immunolocalizzazione, microscopia a forza atomica in fluido e microscopia elettronica scansione ad alta risoluzione) usate per il tendine. I risultati ottenuti da questi esperimenti rappresenteranno tessuti sottoposti, rispettivamente, a carichi meccanici estremi, a carichi meccanici fisiologici ed ad una assenza di carico e ci permetteranno di comprendere meglio le relazioni morfo-funzionali esistenti tra architettura tissutale e richieste funzionali. I risultati attesi da questa ricerca sono: - una migliore comprensione della distribuzione del collagene tipo VI e del suo ruolo fisiologico. In particolare è degno di nota che, nonostante la sua ampia diffusione e la sua vasta gamma di interazioni con le macromolecole della matrice extracellulare, la sola malattia congenita che coinvolge un deficit del collagene tipo VI sia una miopatia e non una patologia del connettivo; - una migliore valutazione delle interazioni funzionali dei preoteoglicani, sia tra loro che con la superficie della fibrilla collagena, in termini di specificità di legame, localizzazione intraperiodo e percentuale di occupazione del sito di legame); - una migliore comprensione e degli adattamenti funzionali indotti da variazione del carico funzionale nello stesso organo (tendine); - una migliore comprensione delle specializzazioni morfo-funzionali indotte in diversi tessuti in risposta ai differenti carichi funzionali a cui questi ultimi sono sottoposti.