RICERCA ITALIANA     

Approccio multidisciplinare alla conservazione dell'Asino dell'Amiata: riproduzione, allevamento e genetica.

Università di Pisa

Abstract

Considerata l'importanza della conservazione della biodiversità e delle risorse genetiche delle specie domestiche, lo scopo di questo progetto è quello di fornire le conoscenze necessarie da utilizzare nel futuro per un efficace recupero e salvaguardia di una razza autoctona in via di estinzione, l'Asino dell'Amiata. La letteratura scientifica disponibile sulla specie asinina è infatti assai lacunosa, ed è necessario quindi ampliare le conoscenze di base. A tale scopo, verranno valutate la consistenza, la variabilità genetica e le caratteristiche zoometriche della popolazione esistente di asino amiatino. Su stalloni (n=6) e fattrici non gravide (n=6) verranno investigati molteplici aspetti delle caratteristiche riproduttive (caratteristiche seminali e del ciclo estrale), endocrinologiche (ormoni della riproduzione), nonchè aspetti di tecnologie della riproduzione quali la conservazione del seme e degli embrioni. Su fattrici gravide (n=12) e sui loro puledri saranno investigate caratteristiche nutrizionali, zoometriche e cliniche (parametri vitali, ematologici ed ematochimici, valutazioni delle eventuali patologie). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Francesco CAMILLO Università di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo primario di questo progetto è fornire le conoscenze necessarie per un efficace recupero e salvaguardia dell'Asino dell'Amiata.

A tale scopo, sarà valutata la variabilità genetica della popolazione esistente, studio necessario ad una successiva pianificazione degli interventi.

Verranno inoltre indagate le caratteristiche seminali, del ciclo estrale e dell'endocrinologia riproduttiva dell'asino dell'Amiata, nonchè le tecniche di conservazione del seme e degli embrioni.

Verrà valutato il ruolo delle molecole ad attività antiossidante contenute nel seme sulle caratteristiche degli spermatozoi.

Verrà colmato il vuoto di conoscenze elementari di natura nutrizionale, zootecnica e medica ed in particolare a proposito di neonatologia asinina, al fine di ridurre la natimortalità. <<<

Risultati parziali attesi

Nell'ambito della prima fase di questo progetto, i risultati parziali attesi saranno:

- Verifica e definizione della consistenza della popolazione dell'asino dell'Amiata con identificazione degli animali da includere negli studi.

- Determinazione delle caratteristiche ponderali e zoometriche di un numero rappresentativo di soggetti.

- Estrazione del DNA da campioni di sangue, scelta dei marker ed avvio delle tipizzazioni molecolari.

- Verifica dell'effetto della stagione su libido, caratteristiche seminali e concentrazioni di LH, testosterone ed estradiolo 17-beta in stalloni asinini.

- Correlazione tra caratteristiche seminali e capacità di penetrazione da parte degli spermatozoi freschi e conservati di oociti denudati di hamster.

- Verifica dell'effetto della stagione su ciclicità e concentrazioni di LH, progesterone ed estradiolo 17-beta in asine non gravide.

- Digeribilità della dieta somministrata nelle varie fasi della gravidanza.

-Effetto della dieta sul peso della fattrice e del puledro dalla nascita allo svezzamento.

- Parametri ematologici ed ematochimici relativi all'ultimo terzo di gravidanza asinina. Risultati preliminari.

- Parametri vitali, ematologici ed ematochimici dell'asino neonato. Variazioni con l'età ed il sesso. Risultati preliminari.Nell'ambito della seconda fase di questo progetto i risultati parziali attesi saranno:

- Completamento della tipizzazione molecolare, definizione dei profili allelici individuali e loro archiviazione, ed analisi della popolazione.

- Identificazione della tecnica migliore, tra quelle studiate, per la refrigerazione e congelamento del seme asinino.

- Determinazione delle concentrazioni in plasma seminale ed intra-spermatozoali di SOD, CAT, GPX, CoQ10 ed alfa-tocoferolo.

- Effetto dell'utilizzo di seme fresco o refrigerato sulla raccolta embrionale ad 8 giorni.

- Effetto dei media utilizzati per la conservazione degli embrioni sulla vitalità cellulare embrionale.

- Effetto del trattamento con PGF2alfa sulla concentrazione plasmatica di progesterone e sul ritorno in estro delle asine.

- Valutazione della digeribilità della dieta somministrata nella fase due e confronto con la dieta fornita nella prima fase dello studio.

- Integrazione dei parametri già presenti nello standard di razza dell'asino amiatino con le misurazioni lineari e perimetrali effettuate.

- Dati definitivi relativi alla digeribilità nelle varie fasi della gravidanza.

- Effetto della dieta sul peso della fattrice e del puledro dalla nascita allo svezzamento.

- Parametri ematologici ed ematochimici relativi all'ultimo terzo di gravidanza asinina.

- Parametri vitali, ematologici ed ematochimici dell'asino neonato. Variazioni con l'età ed il sesso.

- Valutazione delle eventuali patologie del neonato. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'importanza della conservazione della biodiversità e di mantenere in vita le popolazioni locali è divenuta evidente nel corso dell'ultimo ventennio. Nel 1992, la Conferenza delle Nazioni Unite per l'Ambiente e lo Sviluppo ha riconosciuto la necessità imprescindibile di assicurare la conservazione delle risorse genetiche delle specie domestiche incluse in Agenda 21 e nel testo della Convenzione sulla Biodiversità, ed esiste oggi un ampio consenso riguardo alla necessità di mantenere il livello di variabilità delle razze autoctone. Il patrimonio genetico delle diverse razze e varietà, ritenute minori, ma ognuna con particolari caratteristiche di fertilità, robustezza, resistenza al freddo e alle malattie, potrebbe venire in soccorso, in futuro, a genotipi sicuramente più produttivi, ma certamente anche più fragili. La conservazione delle razze, inoltre, è importante da un punto di vista socio-economico ed ecologico, se si considera come l'allevamento di molte razze autoctone supporti le economie locali di aree marginali (Maijala et al. 1984) e contribuisca alla gestione più rispettosa degli habitats seminaturali (Ostermann 1998). Da non trascurare, infine, il valore culturale delle razze autoctone le quali riflettono, nella maggioranza dei casi, una lunga storia di simbiosi uomo-animale-ambiente rurale e che, attualmente, possono contribuire a mantenere tradizioni e usanze antiche importanti sia da un punto di vista di identità culturale che economico. Le razze autoctone hanno svolto nei secoli un ruolo importante nell'economia dei diversi ambienti, fornendo energia sotto forma di lavoro, cibo, materiale per la tessitura e l'artigianato, sino a quando, con l'industrializzazione dell'agricoltura, l'allevamento si è concentrato su poche specie e razze animali, mentre molte altre sono state messe in disparte e in molti casi si sono avviate all'estinzione (Gandini e Villa 2003). Tra le specie di animali domestici che hanno sofferto di più della meccanizzazione in agricoltura vi sono gli animali utilizzati per il lavoro e, tra questi, gli asini sono quelli che hanno subito nel complesso un più drastico declino numerico con il risultato che, attualmente, molte razze asinine rischiano una rapida estinzione.
L'asino Amiatino, discendendo da asini selvatici africani (Grzimek, 1969), affonda le proprie radici nel periodo etrusco, si è sviluppato in Toscana, diffondendosi principalmente nella zona del Monte Amiata dove all'inizio del ‘900 se ne contavano ben 2500 esemplari. Il numero di asini amiatini ha conosciuto il minimo storico negli anni 70-80, ma la razza è stata preservata dall'estinzione dalla solerzia dell'Istituto Incremento Ippico di Pisa, che ha mantanuto un gruppo di soggetti nella tenuta di Cernaia, vicino a Grosseto, salvando alcune linee genetiche (Baroncini 1987). Oggi l'Asino dell'Amiata è stata dichiarata una razza a rischio d'estinzione dalla Commissione responsabile delle Biodiversità del Parlamento europeo (NL 215/90), dalla FAO (FAO, 2000) e dal Monitoring Institute for Rare Breed and Seed in Europe (2001). Nel 1993 è stata fondata l'Associazione Allevatori Micci Amiatini che, nello statuto, si prefigge scopi quali lo studio, la salvaguardia e la diffusione dell'asino amiatino.
Il conseguimento di questi obiettivi è fortemente ostacolato dalla totale mancanza di dati scientifici inerenti la riproduzione, la nutrizione e l'allevamento, nonchè la genetica dell'Asino Amiatino.

L'uso delle tecnologie della riproduzione e delle banche genetiche può contribuire enormemente alla conservazione delle specie e delle razze in pericolo di estinzione. I benefici vanno dalla distribuzione più efficiente dei geni, per evitare gli effetti avversi della consanguineità, alla possibilità di conservare ed "assicurare" nel tempo i gameti e, di conseguenza, la diversità genetica. L'approccio generale alla conservazione delle specie e delle razze in pericolo di estinzione attraverso le tecnologie della riproduzione è stato, in passato, quello dell'applicazione, spesso senza risultati soddisfacenti, delle tecniche sviluppate negli animali da reddito, principalmente il bovino (Wildt et al 1995). Applicando nella specie asinina i protocolli normalmente utilizzati nel cavallo per il congelamento del seme, l'inseminazione artificiale e l'embryo transfer (ET) sono state osservate percentuali di gravidanza estremamente ridotte (Trimeche et al 1998, Vendramini et al 1997). Questo impone uno studio sulle peculiarità riproduttive dell'asino non ancora individuate o comunque sottovalutate, sia livello di fisiologia maschile e femminile che delle tecniche utilizzate per il trattamento e la conservazione degli spermatozoi e degli embrioni. La letteratura a questo proposito è scarsa e in genere riguarda studi su pochi animali, appartenenti a tipi genetici distanti ed allevati in condizioni ambientali completamente differenti da quelli dell'Asino dell'Amiata (Brasile: Henry et al 1987, Meira et al 1995, Gastal et al 1997a, Gastal et al 1997b), (Stati Uniti: Ginther et al 1987, Blanchard et al 1999). Un'unica ricerca (Carluccio et al, 2003)descrive le caratteristiche riproduttive di una razza Italiana, l'Asino di Martina Franca. Tutti questi studi, tra l'altro, non consentono una conclusione definitiva sulla presenza o meno di una stagionalità riproduttiva come non forniscono informazioni esaustive sull'endocrinologia del ciclo estrale dell'asina. A questo riguardo, sono state valutate le concentrazioni di gonadotropine in diversi momenti della fase follicolare e luteinica (Vandeplassche et al 1981) e la concentrazione di estrogeni e progesterone durante il ciclo estrale (Henry et al 1987; Meira et al 1995). Le concentrazioni di progesterone durante il diestro appaiono più alte di quelle descritte nella cavalla. Questi risultati, se confermati nell'Asino dell'Amiata, potrebbero indicare una differenza nella funzionalità del corpo luteo rispetto a quello della cavalla, ed avere un significato importante per quanto riguarda la sincronizzazione degli estri e la risposta alla prostaglandina F2alfa.
La tecnologia della riproduzione nella quale le conoscenze sull'asino sono più lacunose è indubbiamente l'ET, tecnica che consente di aumentare i prodotti di una femmina di pregio. Attualmente, nonostante il recupero embrionale sembri soddisfacente, la percentuale di gravidanze dopo trasferimento risulta assai bassa(Panzani et al., in pubblicazione; Vendramini et al 1997). Questi risultati impongono un approfondimento sulle tecniche dell'ET nell'asino, a partire dall'adeguatezza dei mezzi di mantenimento degli embrioni il cui effetto è valutabile mediante tecniche di colorazione vitale delle cellule embrionali (Lagneaux et a 2000).
Le caratteristiche seminali dell'asino e l'effetto che la stagione ha su queste ultime e sulla libido sono state investigate in animali allevati in Brasile con la conclusione che esistono delle differenze tra asino e cavallo, legate però probabilmente sia alle condizioni ambientali, tipiche della regione tropicale, che alla fisiologia delle due specie (Gastal et al 1997a, Gastal et al 1997b). Non esistono al momento studi sulla funzione endocrina nello stallone asinino durante l'intero arco dell'anno. Poichè nel cavallo la stagione sembra avere un'influenza su alcune caratteristiche seminali e sull'asse ipotalamo-ipofisi-testicolo (Pickett et al, 1970, Berndtson et al 1974, Thompson et al 1977, Thompson et al 1978) ed il momento dell'anno in cui si effettua la raccolta del seme può avere un effetto sulla sua conservabilità (Magistrini et al 1987), risulta indispensabile indagare le caratteristiche riproduttive dell'asino amiatino nell'intero arco dell'anno. La conservazione del seme degli stalloni asinini mediante refrigerazione è stata studiata confrontando alcuni diluenti e temperature di conservazione, ottenendo risultati soddisfacenti in termini di motilità ed integrità delle membrane plasmatiche (Cottorello et al 2002, Serres et al 2002). In un recente studio è stato osservato come la centrifugazione del seme e l'eliminazione del plasma seminale abbia avuto un notevole effetto positivo sulla motilità e l'integrità della membrana plasmatica degli spermatozoi degli asini Zamorano-Leones durante la loro conservazione (Serres et al 2002). Vi sono ancora molti diluenti che, già utilizzati per il seme di stallone, non sono stati testati nell'asino.
Gli studi riguardanti il congelamento del seme nell'asino sono stati quasi esclusivamente riferiti ad una singola razza, l'asino di Poitou, anch'esso in pericolo di estinzione, ed effettuati da un unico gruppo; a partire dalla tecnica descritta da Palmer (1984) per il cavallo hanno proposto un protocollo specifico per gli spermatozoi asinini (Trimeche et al 1998). Crioprotettori diversi dal glicerolo, e mai impiegati per il seme di asino, sono stati testati recentemente per il seme di stallone (Ball et al 2001, Henry et al 2002, Mantovani et al 2002). A tutt'oggi nell'asino sono state descritte solo 8 gravidanze a seguito di inseminazioni artificiali con seme congelato (Trimeche et al 1998), suggerendo che le tecniche di conservazione abbiano ancora ampi margini di miglioramento.

Una correlazione è stata confermata tra la diminuzione della motilità spermatica, la mancata penetrazione dello spermatozoo nell'oocita e la ridotta fertilità e la presenza di specie reattive ossigenate (ROS) (Aitken e Clarkson 1989, Alvarez et al 1987, De Lamirande & Gagnon 1992, Iwazaky & Gagnon 1992). Le ROS sono state anche osservate aumentare durante il processo di conservazione del seme (Mazzilli et al 1995, Chatterjee et al 2001). Nel plasma seminale e nello stesso spermatozoo esistono dei sistemi di difesa (enzimatici e non enzimatici) che mantengono un equilibrio tra la produzione ed il metabolismo di queste specie reattive ossigenate. Tre enzimi costituiscono la base di questo sistema di protezione: la Superossido Dismutasi (SOD) (Nissen et al 1983), la catalasi (CAT) (Jeulin et al 1989) ed il sistema glutatione perossidasi/reduttasi (GPX) (Alvarez et al 1989). Esistono inoltre anche sistemi di difesa non enzimatici, tra cui molto attivo è il Coenzima Q10 (CoQ10). I livelli del CoQ10 tendono infatti ad aumentare in risposta ad insulti perossidativi sulla membrana degli spermatozoi e, nell'uomo, è stata evidenziata una correlazione inversa tra il CoQ10 ed alcune caratteristiche del seme che evidenziano un suo importante ruolo come marker biochimico di alterazioni seminali (Mancini et al 1994, Angelitti et al 1995, Ducci et al 1997). Nella specie equina bassi livelli di CoQ10 risultano correlati con alte percentuali di spermatozoi mobili e morfologicamente normali (Ducci et al 1999).


La caratterizzazione e la valutazione del patrimonio genetico rappresenta un prerequisito indispensabile per l'individuazione di adeguate strategie di conservazione; in tale ambito, gli strumenti forniti dalla biologia molecolare consentono di approfondire le conoscenze relative al livello di variabilità ed alla stratificazione genetica della popolazione. Negli anni recenti è stato avviato un numero crescente di progetti di ricerca relativi alla valutazione dei principali parametri genetici a scopo conservativo nelle principali specie domestiche (Hall e Bradley 1995, Crawford e Littlejohn 1998). La maggior parte dei progetti sono attualmente basati sull'adozione di marcatori molecolari microsatelliti, ormai riconosciuti come strumenti efficaci per la gestione e la conservazione della biodiversità anche nelle popolazioni minacciate di estinzione. Sono ancora poche, tuttavia, le pubblicazione che descrivono l'utilizzo di marcatori biochimici e del DNA nell'asino. Marcatori molecolari microsatelliti sono stati isolati nella specie asinina ma solo in un numero limitato di pubblicazioni sono stati utilizzati per l'analisi precipua di questa specie (i.e. Bellone et al 1998, Jordana et al 2001, Ivankovic et al 2002). L'analisi della struttura genetica e della sua variabilità, mediante le strategie statistiche di elaborazione dei dati genealogici e l'aiuto delle metodologie molecolari, soprattutto per una piccola popolazione come quella dell'Asino dell'Amiata, può fornire un efficace mezzo per la scelta dei riproduttori a miglior valore genetico, ma anche per programmare più ampie azioni di intervento e di recupero. Questo considerando che il valore di una banca genetica dipende anche da quanto i maschi, dei quali è stato conservato il seme, sono distanti geneticamente tra loro e dalle popolazioni future (Harnal et al 2002).

La bibliografia scientifica relativa all'allevamento ed alla nutrizione dell'asino in generale e all'asino dell'Amiata in particolare è scarsa, datata se non addirittura inesistente (Baroncini 1987, Svendsen 1989). Numerosi lavori scientifici sono riferiti soprattutto all'allevamento e alla gestione delle popolazioni asinine africane e asiatiche (Aganga et al 2000, Wilson, 1990) che poco o niente hanno a che fare con le esigenze di allevamento degli asini in Italia.
Nonostante l'asino sia notoriamente un animale capace di sopravvivere in condizioni estreme, in caso di aumentati fabbisogni, come durante la gravidanza e l'allattamento, il corretto razionamento diventa di estrema importanza per mantenere l'animale in salute e conservare l'efficienza riproduttiva. Sebbene le informazioni riguardo i fabbisogni dell'asino siano scarse e non esaustive, alcuni lavori hanno fornito alcune indicazioni sulla sua nutrizione (Svendsen 1989, Pearson 1992). Nei paesi dove l'asino è stato maggiormente studiato i principali problemi sono legati alla malnutrizione per l'uso di diete sbilanciate. Il problema diventa particolarmente grave durante la gravidanza e l'allattamento. La domanda energetica elevata, non accompagnata da un corretto razionamento, provoca un rapido scadimento delle condizioni fisiche, accompagnato da effetti negativi sulla riproduzione e sulla sopravvivenza del neonato (Mohammed 1991). I fabbisogni nutrizionali del cavallo sono stati largamente studiati, ma l'asino differisce considerevolmente da questa specie e pochi lavori hanno esplorato le differenze tra cavallo e asino (Pearson e Merritt 1991, Pearson et al 1992). La necessità di indagare le esigenze nutrizionali dell'asino diventa, quindi, di estrema importanza.
Le conoscenze sulla neonatologia equina sono molto approfondite e diffuse, come documentato da un'abbondante letteratura. Sfortunatamente non esiste letteratura specifica riguardo la specie asinina e al momento mancano le conoscenze di base a proposito dei dati clinici vitali e del loro cambiamento nei primi giorni di vita, in risposta all'adattamento alla vita extrauterina, riguardo al puledro asinino. Non si conoscono notizie epidemiologiche riguardo alle malattie specifiche del periodo neonatale nell'asino (prematurità, fallimento del trasferimento dell'immunità passiva, sindrome da asfissia neonatale, sepsi, etc.). <<<